[發明專利]一種基于SNP分子標記鑒定洋蔥雄性不育三系配套雜交種純度的方法

有效

• 申請號: 202211069640.9
• 申請日: 2022-08-31
• 公開（公告）號: CN115852017B
• 公開（公告）日: 2023-09-15
• 發明（設計）人: 楊妍妍;劉冰江;霍雨猛;李艷偉;王振寶;孫亞玲;吳雄
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 張曉鵬

1.一種基于SNP分子標記鑒定洋蔥雄性不育三系配套雜交種純度的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

（1）提取待鑒定的洋蔥雜交種及其親本種子的DNA；

（2）對提取的DNA進行KASP-PCR擴增；

（3）PCR反應結束后，在酶標儀上進行讀板，采用SNPviewer軟件對掃描數據進行分析，根據分析結果鑒定洋蔥雜交種的真實性和純度；

（1）中，?DNA的提取方法為：取洋蔥種子于離心管中，加入TPS緩沖液和RNase，種子破碎后水浴加熱30分鐘，離心；取上清液至離心管中，加入等體積的異丙醇，充分混勻后離心，棄上清；加入乙醇，渦旋振蕩后離心，棄上清；徹底晾干殘余的乙醇后加入無菌ddH₂O，溶解DNA沉淀，凍存備用；

（2）中，特異性引物組合含有2條上游引物HI-MS、HI-ms?和1條下游引物HI-C，兩條上游引物5'端連接有熒光標簽序列，3'末端包含等位變異堿基C/G；

所述特異性引物核苷酸序列如SEQ?ID?No.1、SEQ?ID?No.2、SEQ?ID?No.3所示；

引物HI-MS和HI-C擴增讀出父本自交系種子，擴增產物的熒光信號呈黃色圓點標記；HI-ms和HI-C擴增讀出母本不育系的種子，擴增產物的熒光信號呈紅色圓點標記；真實的洋蔥雜交種，HI-MS，HI-ms都有可以與HI-C擴增，擴增產物的熒光信號呈綠色圓點標記；

（3）中，采用SNPviewer軟件對掃描數據進行分析具體為，若待測DNA擴增產物的熒光信號數據經SNPviewer分析后呈紅色圓點標記，則該洋蔥種子的細胞核基因型為隱形純合的msms，為母本不育系的種子；若待測DNA擴增產物的熒光信號呈黃色圓點標記，則該洋蔥種子的細胞核基因型為顯性純合的MsMs，為父本自交系種子；若待測DNA擴增產物的熒光信號呈綠色圓點標記，則該洋蔥種子的基因型為雜合的Msms，為真實的洋蔥雜交種；

（3）中，所述方法還包括純度計算步驟，計算雜交種子粒數占檢測種子總粒數的百分比。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，水浴加熱過程中顛倒混勻2-3次。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，70-90℃水浴加熱30分鐘。

4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，80℃水浴加熱30分鐘。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述乙醇為60-90%乙醇。

6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述乙醇為70%乙醇。

7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，（2）中，PCR擴增的反應程序包括：90-95℃預變性15?min；90-95℃變性20?s，61-55℃退火1?min，每一個循環降低0.6℃，10個循環；90-95℃變性20?s，61-55℃退火1?min，26-29個循環。

8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，（2）中，PCR擴增的反應程序包括：94℃預變性15?min；94℃變性20?s，61-55℃退火1?min，每一個循環降低0.6℃，10個循環；94℃變性20s，55℃退火1?min，26-29個循環。