[發明專利]一種新型多巖藻糖支鏈FCS、制備方法及其緩解高糖損傷的應用

在審

• 申請號: 202211048589.3
• 申請日: 2022-08-30
• 公開（公告）號: CN115433749A
• 公開（公告）日: 2022-12-06
• 發明（設計）人: 李惠靜;公丕賢;吳彥超
• 申請（專利權）人: 威海海洋生物醫藥產業技術研究院有限公司
• 主分類號: C12P19/04
• 分類號: C12P19/04;A23L33/125;A61K31/715;A61P3/10
• 代理公司: 威海科星專利事務所 37202
• 代理人: 王玲燕

本發明提供一種新型多巖藻糖支鏈FCS、制備方法及其緩解高糖損傷的應用，將海參粉膠原酶和基質金屬蛋白酶初步酶解、光譜蛋白酶繼續酶解，經醇沉得粗多糖后，一步膜分離即可得純凈FCS，經核磁結構測定和三級質譜測定主鏈二糖結構，得到FCS的精細結構為含雙巖藻糖結構的FCS多糖，FCS可緩解高糖浸泡對于斑馬魚胚胎的損傷。

技術領域

本發明涉及醫療保健技術領域，具體地說是一種新型多巖藻糖支鏈FCS、制備方法及其緩解高糖損傷的應用。

背景技術

眾所周知，糖尿病是一種常見的代謝性疾病，胰島素缺陷或胰島素抵抗導致的糖相關代謝異常是糖尿病的主要發病機制。目前世界上DM患病人數約4.2億，預計2040年患病人數將增至6.42億。根據發病原因，糖尿病可被細分為Ⅰ型，Ⅱ型，妊娠和其他類型。其中，I型糖尿病以胰島β細胞功能異常為發病機理，表現為胰島素分泌不足，典型的治療方法為胰島素注射。而Ⅱ型糖尿病在總患病人數中的比例最大，約占成人糖尿病發病類型的90 %以上，且病癥最復雜，常伴有腎臟損傷，心血管系統疾病，視網膜病變及泌尿系統損傷等與細胞損傷相關的并發癥。長期高糖會對多種調控通路產生損傷，如產生氧化應激，而氧化應激是多種糖尿病并發癥的基石。因此，尋找可減輕高糖損傷的天然藥物，對II型糖尿病及其并發癥的治療具有重要意義。

海參是歸屬于無脊椎動物棘皮動物門(Echinodermata)海參綱(Holothuridea)的無脊椎動物，是海洋中重要的食物和藥物資源，有著極高的營養價值，味道鮮美。近幾年來，國內外在海參的生物活性物質及其藥理作用等方面的研究較多，已經先后從幾十種海參中分離獲得了多種活性物質，包括多肽、蛋白質、多糖、脂類、三萜皂苷、凝集素、神經肽和糖肽。海參多糖目前研究較多的是海參硫酸軟骨素 （FCS）等含有硫酸根的多糖，且海參硫酸酯多糖因其結構與肝素類似，目前對FCS抗糖尿病的研究多集中于對胰島素抵抗等影響血糖指標的直接作用，而對于高糖損傷的應用研究較少。目前海參多糖的提取方法多為木瓜蛋白酶解法，但其實木瓜蛋白酶雖然為廣譜蛋白酶，但是對于膠原蛋白的酶解能力并不強，因此需要的酶解時間過長，且其酶解溫度較高，因此限制了其制備工藝的應用。已經有文獻報道，海參FCS通過共價鍵連接于膠原蛋白纖維，因此需要找到更加特異性的酶，預先處理海參體壁，從而縮短制備時間，并提高得率。目前所得FCS結構皆為單巖藻糖支鏈，且主鏈的二糖結構很難確定。

發明內容

本發明的目的是解決上述現有技術的不足，提供一種新型多巖藻糖支鏈FCS、制備方法及其緩解高糖損傷的應用。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：

一種新型多巖藻糖支鏈FCS，其特征在于多巖藻糖支鏈FCS的結構如下：

一種新型多巖藻糖支鏈FCS的制備方法，其特征在于制備方法的步驟如下：

（1）淡干海參粉碎，加入膠原酶和基質金屬蛋白酶酶解；加入商品化廣譜蛋白酶繼續酶解，煮沸滅酶后，離心收集上清，醇沉后收集沉淀，重溶，透析得粗多糖溶液；

（2）粗多糖溶液通過截留分子量80-150 kDa膜一步分離，濾出液凍干即為純FCS；

本發明所述的步驟（1）中所述膠原蛋白酶和基質金屬蛋白酶的總添加量為2000U/g海參粉，酶解溫度為 25~35 ℃，酶解時間為1-2 h；廣譜蛋白酶選用菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶中的任意一種或兩種以上結合，酶解溫度為25~35 ℃，酶解時間為3-5 h。

本發明所述的步驟（2）得到的純FCS進行核磁測定，三級質譜法測定主鏈二糖結構。

本發明所述的三級質譜的樣品前處理采用稀硫酸去除巖藻糖支鏈，硫酸軟骨素酶ABC酶解得主鏈二糖；質譜參數為選用Obitrap系列質譜儀的數據依賴性負離子掃描模式，每一級掃描設置上一級掃描的響應值前三的離子片段觸發離子打碎。掃描范圍100~500Da，分辨率70000，錐孔電壓100 V，碰撞能35 eV。