[發(fā)明專利]基于非天然氨基酸的離子液體、其制備方法及應用

有效

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• 申請日: 2022-08-29
• 公開（公告）號: CN115261344B
• 公開（公告）日: 2023-07-21
• 發(fā)明（設計）人: 夏青;石玉杰;史寧寧
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C12N9/00
• 分類號: C12N9/00;C12N15/85;A61P21/00
• 代理公司: 北京市隆安律師事務所 11323
• 代理人: 楊云

1.一種用于制備含非天然氨基酸蛋白的物質組合，包括：

(1)一種或多種氨基酰-tRNA合成酶，其能夠結合突變的tRNA；

(2)一種或多種突變的tRNA，所述突變的tRNA反密碼子環(huán)上突變?yōu)榻K止密碼子的互補序列；

(3)基于非天然氨基酸的離子液體，所述基于非天然氨基酸的離子液體為非天然氨基酸-膽堿離子液體，其以膽堿和非天然氨基酸為原料通過化學合成產(chǎn)生；

其中，(1)所述的氨基酰-tRNA合成酶能將(2)所述突變的tRNA結合到非天然氨基酸上產(chǎn)生氨基酰-tRNA；并且

所述基于非天然氨基酸的離子液體與非天然氨基酸相比具有改善的溶解度、和/或生物利用度；

所述氨基酰-tRNA合成酶為來自馬氏古甲烷球菌的MmPylRs、突變的tRNA為tRNAMmPylUCA；

所述氨基酰-tRNA合成酶為來自大腸桿菌的EcLeuRs、突變的tRNA為tRNAEcLeuCUA；

所述氨基酰-tRNA合成酶為來自大腸桿菌的EcTyrRs、突變的tRNA為tRNAEcTyrUUA。

2.如權利要求1所述用于制備含非天然氨基酸蛋白的物質組合，其特征在于，所述非天然氨基酸-膽堿離子液體為Ch-NAEK、Ch-pAcF、Ch-Anap。

3.一種重組表達含非天然氨基酸目的蛋白的方法，其特征在于利用權利要求1-2任一所述用于制備含非天然氨基酸蛋白的物質組合在目的蛋白中插入非天然氨基酸。

4.如權利要求3所述的方法，其特征在于利用大腸桿菌、酵母、哺乳動物細胞、昆蟲細胞作為宿主細胞重組表達含非天然氨基酸蛋白；所述非天然氨基酸由提前終止密碼子(PTC)編碼。

5.如權利要求4所述的方法，其包括：

步驟1.改造宿主細胞，使其表達所述一種或多種氨基酰-tRNA合成酶、和所述一種或多種突變tRNA；

步驟2.向步驟1獲得的改造宿主細胞中轉入含非天然氨基酸蛋白編碼核酸的表達盒，制備重組宿主細胞；

步驟3.在添加基于非天然氨基酸的離子液體的培養(yǎng)基中培養(yǎng)步驟2獲得的重組宿主細胞。

6.如權利要求5所述的方法，在步驟3之后還包括：

步驟4.培養(yǎng)重組宿主細胞、從培養(yǎng)物中分離含非天然氨基酸目的蛋白。

7.基于非天然氨基酸的離子液體在提高基因密碼子拓展系統(tǒng)對提前終止密碼子(PTC)通讀效率、和/或插入非天然氨基酸效率中的應用，

其中，所述基因密碼子拓展系統(tǒng)包括：

(1)一種或多種氨基酰-tRNA合成酶，其能夠結合突變的tRNA；和

(2)一種或多種突變的tRNA，所述突變的tRNA反密碼子環(huán)上突變?yōu)榻K止密碼子的互補序列；

并且，(1)所述的氨基酰-tRNA合成酶能將(2)所述突變的tRNA結合到非天然氨基酸上產(chǎn)生氨基酰-tRNA；

所述基于非天然氨基酸的離子液體為Ch-NAEK、Anap-膽堿、pAcF-膽堿；

所述氨基酰-tRNA合成酶為來自馬氏古甲烷球菌的MmPylRs、突變的tRNA為tRNAMmPylUCA；

所述氨基酰-tRNA合成酶為來自大腸桿菌的EcLeuRs、突變的tRNA為tRNAEcLeuCUA；

所述氨基酰-tRNA合成酶為來自大腸桿菌的EcTyrRs、突變的tRNA為tRNAEcTyrUUA。

8.如權利要求7所述的基于非天然氨基酸的離子液體在提高基因密碼子拓展系統(tǒng)對提前終止密碼子(PTC)通讀效率、和/或插入非天然氨基酸效率中的應用，其特征在于以所述基于非天然氨基酸的離子液體替代或部分替代非天然氨基酸，加入重組細胞培養(yǎng)基中。

9.如權利要求7所述的基于非天然氨基酸的離子液體在提高基因密碼子拓展系統(tǒng)對提前終止密碼子(PTC)通讀效率、和/或插入非天然氨基酸效率中的應用，其中所述非天然氨基酸的離子液體是以膽堿和非天然氨基酸為原料通過化學合成產(chǎn)生，其中膽堿和非天然氨基酸的摩爾比為1:0.1-10。