[發明專利]月季細胞的快速懸浮培養方法和高效遺傳轉化方法

在審

• 申請號: 202211026025.X
• 申請日: 2022-08-25
• 公開（公告）號: CN116083339A
• 公開（公告）日: 2023-05-09
• 發明（設計）人: 馬男;王成鵬;周曉鋒;高俊平;程晨霞;李揚;王娜;俞芹
• 申請（專利權）人: 中國農業大學;山東省農業科學院
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C12N5/02;C12N15/84
• 代理公司: 濟南誠智商標專利事務所有限公司 37105
• 代理人: 韓百翠

1.一種月季細胞的快速懸浮培養方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

(1)愈傷組織的誘導：選取月季幼嫩葉片，將選取的月季幼嫩葉片接種到誘導培養基中，進行愈傷組織誘導培養；將誘導的愈傷組織轉移至增殖培養基中，進行增殖培養；

(2)懸浮細胞的制備：選取步驟1)增殖培養1個月的愈傷組織；將選取的愈傷組織接種到無凝膠的增殖培養基中；將該培養基置于恒溫震蕩培養箱中進行培養，獲得穩定的初代懸浮細胞；

(3)懸浮細胞的繼代培養：選取步驟2)獲得的初代懸浮細胞再接種于無凝膠的增殖培養基上；將該無凝膠增殖培養基置于恒溫震蕩培養箱中培養，進而獲得繼代培養的月季懸浮細胞；

(4)繼代培養懸浮細胞的保存：對步驟3)獲得的含有繼代培養的月季懸浮細胞的無凝膠增殖培養基進行過濾，獲得繼代培養的月季懸浮細胞，取該細胞置于含凝膠的增殖培養基上進行繼代保存。

2.根據權利要求1所述的快速懸浮培養方法，其特征在于，步驟1)所述誘導培養基成分包括4.40g·L^-1-4.45g·L^-1MS?salt、2.5mg·L^-1-3.5mg·L^-12,4-D、0.05mg·L^-1KT、30g·L^-1Glucose、0.3％Gel。

3.根據權利要求1所述的快速懸浮培養方法，其特征在于，步驟1)所述增殖培養基包括4.40g·L^-1-4.45g·L^-1MS?salt、0.8mg·L^-1-1.2mg·L^-12,4-D、0.8mg·L^-1-1.2mg·L^-16-BA、6％Glucose、0.3％Gel。

4.根據權利要求1所述的快速懸浮培養方法，其特征在于，步驟1)中所述愈傷組織誘導培養的條件是25℃，黑暗條件下，時間是2周；所述增殖培養的條件是25℃，黑暗條件下。

5.根據權利要求1或2所述的快速懸浮培養方法，其特征在于，步驟2)所述培養的條件是25℃，黑暗條件下，130rpm/min震蕩培養，每周更換一次培養基，持續4至8周，每周清除大塊愈傷。

6.一種使用權利要求1所述的月季懸浮細胞的高效遺傳轉化方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

(1)載體轉化農桿菌：將質粒轉化到農桿菌菌株中，挑選轉化成功的單菌落，接種于LB液體培養基中培養，離心去除上清液，收集陽性農桿菌；

(2)用MS重懸溶液重懸步驟1)離心收集的陽性農桿菌，從而獲得侵染液；

(3)過濾并收集權利要求1中所述的月季懸浮細胞；

(4)將步驟3)獲得的月季懸浮培養細胞置于步驟2)獲得的侵染液中進行侵染，獲得已轉染的懸浮細胞；

(5)共培養：取步驟4)獲得的已轉染的懸浮細胞，置于共培養培養基中共培養；

(6)篩選培養：取步驟5)共培養結束的懸浮細胞，置于選擇增殖培養基中進行選擇培養，獲得月季懸浮細胞團。

7.根據權利要求6所述的高效遺傳轉化方法，其特征在于，步驟2)所述MS重懸溶液包括4.40g·L^-1-4.45g·L^-1MS?salt、8mM-12mM?MES、8mM-12mM?MgCl₂、3％Glucose、180μM-220μMAS。

8.根據權利要求6所述的高效遺傳轉化方法，其特征在于，步驟5)所述共培養培養基的成分包括4.40g·L^-1-4.45g·L^-1MS?salt、0.8mg·L^-1-1.2mg·L^-12,4-D、0.8mg·L^-1-1.2mg·L^-16-BA、4.5％Glucose、0.3％Gel。