[發明專利]敲除磷脂酶D基因的裂殖壺菌基因工程菌株及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 202210986944.5
• 申請日: 2022-08-17
• 公開（公告）號: CN115975823A
• 公開（公告）日: 2023-04-18
• 發明（設計）人: 凌雪萍;李科燕;盧英華;崔瀟文;陳翠雪
• 申請（專利權）人: 廈門大學
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12N15/80;C12P7/6434;C12R1/645
• 代理公司: 廈門市首創君合專利事務所有限公司 35204
• 代理人: 秦彥蘇

本發明公開了敲除磷脂酶D基因的裂殖壺菌基因工程菌株及其構建方法和應用。本發明采用裂殖壺菌Schizochytrium?limacinum?SR21為原始菌株，通過基因工程手段在大腸桿菌中構建敲除載體，以PLD基因的上下游序列作為同源臂，以博來霉素基因替換PLD基因并作為篩選抗性基因，得到一株高產DHA的基因工程菌株，為基因工程調控裂殖壺菌高產DHA提供了新的思路。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種敲除磷脂酶D基因的裂殖壺菌基因工程菌株及其構建方法和應用。

背景技術

裂殖壺菌(Schizochytrium)作為多不飽和脂肪酸(PUFAs)的優質生產者，因其生長速度快、油脂含量高、DHA比例高，是工業化生產PUFAs和DHA的代表性菌株。國內外科學家對于裂殖壺菌中PUFAs的合成機制進行了廣泛的研究，發現裂殖壺菌PUFAs合成的途徑包括脂肪酸合成酶(FAS)途徑和聚酮合成酶(PKS)途徑，其中裂殖壺菌DHA合成被認為主要與PKS途徑有關。最近的研究發現裂殖壺菌中DHA的生產不僅僅取決于DHA的合成過程，還取決于DHA合成后遷移、積累和儲存的裝配形式。裂殖壺菌中DHA的儲存形式主要為甘油三酯，還有的是以磷脂和甾醇酯形式存在，甘油酯、磷脂和甾醇酯相互轉化的過程中也會伴隨著脂肪酸的遷移，其過程與磷脂代謝密切相關。因此優化裂殖壺菌的磷脂代謝過程對于裂殖壺菌DHA合成具有重要意義。

磷脂酶D專一性水解磷脂中的磷酸二酯鍵，主要催化兩類反應：(1)水解反應；(2)轉磷脂酰反應。磷脂酶D能夠通過水解作用調節TAG和磷脂的分配，也能夠通過轉磷脂酰作用使不同類型磷脂之間發生轉化。調控磷脂酶D的表達會影響裂殖壺菌的磷脂代謝，進而會對裂殖壺菌的油脂及DHA合成產生影響。但截止目前還沒有在裂殖壺菌中調控磷脂酶D影響裂殖壺菌油脂合成和脂質儲存形式的報道。

發明內容

本發明的目的在于從一定程度上解決了現有技術的不足之處，提供了敲除磷脂酶D基因的裂殖壺菌基因工程菌株及其構建方法和應用。本發明以Schizochytriumlimacinum?SR21為原始菌株，通過敲除PLD基因來調控裂殖壺菌脂質儲存形式，進而加強DHA的合成。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案之一是：

一種敲除磷脂酶D(PLD)基因的裂殖壺菌基因工程菌株，所述基因工程菌株是以Schizochytrium?limacinum?SR21為原始菌株構建而成，所述基因工程菌株的基因組中PLD基因被敲除，降低了所述基因工程菌株中的PLD表達水平。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案之二是：

一種敲除PLD基因的裂殖壺菌基因工程菌株的構建方法，包括：

(1)克隆來源于野生型菌株Schizochytrium?limacinum?SR21基因組中PLD基因的上下游同源臂，插入到pBlue-zeo質粒的同源重組區域，構建以博來霉素為抗性的PLD基因敲除載體pBlue-zeo-PLD；

(2)用所述PLD基因敲除載體pBlue-zeo-PLD的同源重組區域線性化后，電轉化導入Schizochytrium?limacinum?SR21感受態細胞中，獲得敲除磷脂酶D基因PLD的裂殖壺菌基因工程菌株。

進一步地，所述步驟(1)中，PLD基因敲除載體pBlue-zeo-PLD的構建方法包括：根據裂殖壺菌Schizochytrium?limacinum?SR21的PLD基因的序列信息，設計如SEQ?ID?No.3～SE1?ID?No.6所示的引物，通過PCR擴增得到PLD基因上游同源臂和PLD基因下游同源臂；將得到的PLD基因上游同源臂和PLD基因下游同源臂依次與質粒pBlue-zeo經酶切、連接后轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞，獲得所述敲除載體pBlue-zeo-PLD。