[發明專利]一種基于多重連接探針擴增技術鑒別蒼術與關蒼術的方法

在審

• 申請號: 202210980859.8
• 申請日: 2022-08-16
• 公開（公告）號: CN116397038A
• 公開（公告）日: 2023-07-07
• 發明（設計）人: 汪波;聶晶;胡敏;莫靜;徐玲;程華春;費毅琴
• 申請（專利權）人: 湖北省藥品監督檢驗研究院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6816;C12N15/11
• 代理公司: 武漢智嘉聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 42231
• 代理人: 徐紹新

本發明公開了一種基于多重連接探針擴增技術鑒別蒼術與關蒼術的方法，包括以下步驟：提取樣品基因組DNA；利用植物ITS2序列通用擴增引物對蒼術、關蒼術的ITS2序列進行擴增；將擴增產物變性后與MLPA探針雜交；利用DNA連接酶將雜交產物進行連接；利用通用引物對連接產物進行實時熒光定量PCR擴增；收集熔解曲線信號，觀測Tm值。本發明能夠在很短的時間內鑒別中藥材蒼術及其常見混偽品關蒼術，該方法具有特異性強、靈敏度高等優點，在中藥材真偽鑒定領域有很好的應用前景。

技術領域

本發明屬于中藥材鑒定領域，具體涉及一種基于多重連接探針擴增技術鑒別蒼術與關蒼術的方法。

背景技術

2020版《中國藥典》收載的蒼術為菊科植物茅蒼術Atractylodes?lancea(Thunb.)DC.或北蒼術Atractylodes?chinensis(DC.)Koidz.的干燥根莖，其富含炔類、多糖以及倍半萜等多種藥效成分，具有燥濕健脾、祛風散寒、明目等功效，現代藥理學研究表明其在抗癌、抗炎、抗菌和保護胃腸道等方面也具有明顯的藥理作用。近年來，過度開采和生長環境的破環造成蒼術野生資源匱乏，不法商家為牟取利益而將類似藥材假冒蒼術出售，造成蒼術市場秩序混亂，嚴重威脅了蒼術的臨床用藥安全和市場監管。關蒼術為蒼術的同屬植物，雖未被《中國藥典》收載，但在北方地區常把關蒼術的干燥根莖作為北蒼術藥用。有研究發現，關蒼術的藥用成分與白術更相似，甚至在日本藥典中是作為藥材白術的基源物種之一。將關蒼術誤用為蒼術不僅達不到預期的治療目的，甚至可能造成患者病癥加重。由于關蒼術的外觀性狀、化學成分與蒼術具有較高的相似性，通過顏色、氣味、顯微結構和薄層色譜等傳統中藥材鑒別方法難以準確鑒別兩者。因此，開發快速、準確的鑒別蒼術與關蒼術的方法對蒼術的臨床安全用藥和市場監管具有重要意義。

多重連接依賴探針擴增技術(multiplex?ligation-dependent?probeamplification,MLPA)，是一種高通量新興分子診斷技術，可以在較短時間內檢測核酸序列的差異。MLPA利用DNA變性、雜交、連接并結合PCR反應，在使用少量的DNA的情況下實現在一個反應中檢測多達50個基因組DNA序列的差異。作為一種簡單、經濟的基因檢測方法。MLPA最初是應用于人類疾病的檢測，但其應用已擴展到病毒、過敏原、轉基因物種檢測等方面。此外，MLPA技術在動、植物藥材鑒定也發揮了重要作用，將MLPA與熔解曲線結合可根據探針熔解溫度的差異對中藥材基源進行鑒定，目前已成功應用于名貴中藥材川貝母、龜甲等。與其他分子生物學技術如DNA條形碼、PCR-RFLP、SSR等相比，MLPA法更加簡捷、成本更低廉、更適用于常規中藥材的鑒別。

基于此，有必要開發一種基于多重連接探針擴增技術對中藥材蒼術及其常見混偽品關蒼術進行鑒定的方法。本發明根據蒼術與關蒼術核基因組片段序列差異設計了特異性MLPA探針，由熔解曲線分析得到探針的熔解曲線峰和熔解溫度，根據出峰情況和Tm值的差異來鑒別蒼術與關蒼術，并進行了特異性、靈敏度考察。本發明提供的鑒定方法快速、準確，為蒼術及其制品的用藥安全和市場監管提供科學依據和保障，也為其他中藥材的基源研究提供了參考。

發明內容

本發明的目的是提供一種快速簡捷、穩定可靠、成本低廉的鑒定中藥材蒼術及其常見混偽品關蒼術的鑒定方法。

為實現上述目的，本發明首先開發出一種可快速鑒別蒼術、關蒼術的MLPA探針，該探針由蒼術左探針、關蒼術左探針和一個共同右探針組成，各探針的堿基序列如下：

蒼術左探針C-LPO：5’-GGGTTCCCTAAGGGTTGGACCTCGCGCTTGGTCTCCAGTTCCCATGGTACGGC-3’(SEQ?ID?NO:1)

關蒼術左探針G-LPO：5’-GGGTTCCCTAAGGGTTGGACTTAATATTTGGTCTCCTGTGCCCACGTTACGGT-3’(SEQ?ID?NO:2)