[發明專利]基因敲除用shRNA、載體系統及應用、建立基因敲除穩轉細胞系的方法

在審

• 申請號: 202210976149.8
• 申請日: 2022-08-15
• 公開（公告）號: CN115927318A
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發明（設計）人: 許晨舟
• 申請（專利權）人: 嘉興市第一醫院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/867;C12N15/65;C12N5/10;C12N15/52;C12R1/91
• 代理公司: 北京澤南知識產權代理有限公司 11656
• 代理人: 羅攀

1.一種基因敲除用shRNA，其特征在于，所述shRNA靶序列選自shRNA1靶序列、shRNA2靶序列、shRNA3靶序列中的至少一種；

其中，所述shRNA1靶序列如SEQ?ID?NO：1所示，所述shRNA2靶序列如SEQ?ID?NO：2所示，所述shRNA3靶序列如SEQ?ID?NO：3所示。

2.一種基因敲除用載體系統，其特征在于，該載體系統包括第一載體、pHelper?1.0載體和pHelper?2.0載體，所述第一載體包括第一啟動子、熒光蛋白表達元件與權利要求1所述的shRNA靶序列，所述shRNA靶序列位于所述第一啟動子和所述熒光蛋白表達元件之間，所述第一啟動子用于啟動shRNA的轉錄；所述pHelper?1.0載體用于編碼病毒結構蛋白，所述pHelper2.0載體用于編碼病毒蛋白外殼。

3.根據權利要求2所述的載體系統，其中，所述第一啟動子選自hU6啟動子、CMV啟動子、H1啟動子中的至少一種。

4.根據權利要求2或3所述的載體系統，其中，所述熒光蛋白表達元件含有第二啟動子、熒光蛋白編碼基因和IRES序列；所述第二啟動子用于啟動熒光蛋白的獨立表達。

5.根據權利要求4所述的載體系統，其中，所述第二啟動子選自CBh啟動子、CMV啟動子、H1啟動子中的至少一種；和/或

所述熒光蛋白編碼基因選自GFP基因、RFP基因、Mcherry基因和YFP基因的至少一種。

6.根據權利要求2所述的載體系統，其中，所述pHelper?1.0載體中包括：

gag基因，所述gag基因用于編碼HIV病毒的結構蛋白；

pol基因，所述pol基因用于編碼HIV病毒的特異性酶；

rev基因，所述rev基因用于編碼調節gag基因和rev基因的調節因子。

7.權利要求2-6中任意一項所述的載體系統在建立基因敲除穩轉細胞系中的應用。

8.一種建立基因敲除穩轉細胞系的方法，其特征在于，該方法包括：

(1)將權利要求2-6中任意一項所述的載體系統轉染目標細胞，得到轉染后的目標細胞；

(2)將所述轉染后的目標細胞進行陽性單克隆篩選，得到目標陽性單克隆，并將所述目標陽性單克隆進行鑒定。

9.根據權利要求8所述的方法，其中，步驟(1)中，所述目標細胞為SMMC-7721細胞；和/或，

步驟(1)中，所述敲減目標基因為MCCC2基因。

10.根據權利要求8或9所述的方法，其中，步驟(2)中，所述篩選包括：將所述轉染后的目標細胞用抗生素或流式細胞儀進行陽性單克隆篩選，以得到目標陽性單克隆；

優選地，步驟(2)中，所述鑒定包括：將所述目標陽性單克隆用熒光顯微鏡觀察和/或熒光定量PCR反應進行鑒定。