[發(fā)明專利]一種羊支原體肺炎平板凝集抗原及其制備方法與應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210968535.2
• 申請日: 2022-08-12
• 公開（公告）號: CN115097146A
• 公開（公告）日: 2022-09-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 沈青春;蔣卉;丁家波;范學(xué)政;鑫婷;張廣智;秦彤;湯新明;梁瑞英;梁琳;李松勵
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/569;G01N33/531;C12N1/20;C12R1/35
• 代理公司: 成都宏田知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 51337
• 代理人: 常利敏

1.一種羊支原體肺炎平板凝集抗原，其特征在于，使用絲狀支原體山羊亞種SZ013株、山羊支原體山羊亞種SY006株和綿羊肺炎支原體MY018株制成，其中3種支原體菌體的滅活前濃度均為7.0×10¹⁰CCU/mL。

2.一種權(quán)利要求1所述的羊支原體肺炎平板凝集抗原的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將絲狀支原體山羊亞種SZ013株、山羊支原體山羊亞種SY006株和綿羊肺炎支原體MY018株分別接種于羊支原體培養(yǎng)基，傳代后制成3種基礎(chǔ)種子菌液；

(2)將3種基礎(chǔ)種子液分別接種于羊支原體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，獲得3種生產(chǎn)種子液；

(3)將3種生產(chǎn)種子液分別進行發(fā)酵培養(yǎng)，并對菌液進行CCU計數(shù)和無菌檢驗；

(4)在3種發(fā)酵培養(yǎng)菌液中分別加入含硫柳汞的PBS重懸滅活，按CCU計數(shù)結(jié)果調(diào)整菌液濃度，將3種重懸后的菌液按體積比1:1:1混合，加入結(jié)晶紫溶液染色和甘油制備得到羊支原體肺炎平板凝集抗原，混勻后分裝保存。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的羊支原體肺炎平板凝集抗原的制備方法，其特征在于，具體包括以下步驟：

(1)基礎(chǔ)種子液的制備：取絲狀支原體山羊亞種SZ013株、山羊支原體山羊亞種SY006株和綿羊肺炎支原體MY018株凍干菌種，開啟后，分別按10％的量接種羊支原體培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)18～36h收獲后作為一級基礎(chǔ)種子，將一級種子液按10％比例再接種傳代1次，收獲分裝后置-80℃凍存，作為二級基礎(chǔ)種子；

(2)生產(chǎn)種子液的制備：取絲狀支原體山羊亞種SZ013株、山羊支原體山羊亞種SY006株和綿羊肺炎支原體MY018株的二級基礎(chǔ)種子，按10％比例分別接種于生產(chǎn)用羊支原體培養(yǎng)基，置37℃恒溫搖床，120rpm震蕩培養(yǎng)18～36h至培養(yǎng)基變?yōu)辄S色，擴大培養(yǎng)，獲得生產(chǎn)種子液；

(3)發(fā)酵培養(yǎng)：采用生物反應(yīng)器分別大規(guī)模培養(yǎng)絲狀支原體山羊亞種SZ013株、山羊支原體山羊亞種SY006株和綿羊肺炎支原體MY018株，先對生物反應(yīng)器進行滅菌，無菌加入羊支原體培養(yǎng)基，按1:10的比例接種生產(chǎn)種子液，37℃恒溫培養(yǎng)，嚴格控制不通氣，待pH下降至6.9～7.0時，添加羊支原體培養(yǎng)基為原培養(yǎng)體積的20％，進行兩次補料培養(yǎng)，待第二次培養(yǎng)pH下降到6.7～6.8時收獲菌液，并對菌液進行CCU計數(shù)和無菌檢驗；

(4)抗原制備，在3種菌液中分別加入0.2～0.4％羥甲基纖維素鈉，置2～8℃靜置7～10日，8000rpm離心菌液20min，取沉淀用含0.01％硫柳汞的PBS重懸，按照CCU計數(shù)結(jié)果，調(diào)整菌液濃度為2.3×10¹¹CCU/mL，置37℃滅活3小時，將3種重懸后的菌液按體積比1:1:1混合，反復(fù)攪拌均勻后，加入3％結(jié)晶紫溶液至終濃度為0.03％，繼續(xù)攪拌20分鐘，加入10％菌液體積的甘油，繼續(xù)攪拌10分鐘，即得到羊支原體肺炎平板凝集抗原，分裝后置2～8℃保存。

4.權(quán)利要求1所述的羊支原體肺炎平板凝集抗原在羊支原體肺炎感染檢測中的應(yīng)用。