[發(fā)明專(zhuān)利]用于動(dòng)物組織的裂解液及其在CUT＆Tag中的使用方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210931302.5
• 申請(qǐng)日: 2022-08-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN115141876A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-10-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙云霞;趙書(shū)紅;李新云;付亮亮;郭亞蘋(píng);王道遠(yuǎn);匡仁卓;胡明陽(yáng)
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6806
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6806;C40B50/06;C12Q1/6869
• 代理公司: 深圳國(guó)聯(lián)專(zhuān)利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 44465
• 代理人: 朱嬋姝

1.用于動(dòng)物組織的裂解液，其特征在于，具體由下列重量份數(shù)的組分組成：

所述4-羥乙基哌嗪乙磺酸的pH為7.5，所述乙二胺四乙酸的pH為8.0。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于動(dòng)物組織的裂解液在CUTTag中的使用方法，其特征在于，具體包括下列步驟：

(1)稱(chēng)取動(dòng)物組織樣，DPBS重懸清洗組織樣；

(2)采用對(duì)應(yīng)重量份數(shù)的乙基苯基聚乙二醇或辛基苯基-聚乙烯二醇、曲拉通X-100、甘油溶液、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、氯化鈉、乙二胺四乙酸、蛋白酶抑制劑和去離子水配置的裂解液在4℃條件下，裂解動(dòng)物組織樣，初提細(xì)胞核，獲得細(xì)胞核懸液，顯微鏡觀察細(xì)胞核狀態(tài)；

(3)采用濃度為37％的低濃度甲醛固定細(xì)胞核中DNA-蛋白質(zhì)之間的互作信息：

采用37％的低濃度甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞核2分鐘，2.5M甘氨酸在室溫條件下，終止交聯(lián)5分鐘，顯微鏡計(jì)數(shù)，取20-30萬(wàn)個(gè)細(xì)胞核；

(4)制備完整細(xì)胞核：采用下面兩種方法中的其中一個(gè)即可

①細(xì)胞核與經(jīng)處理的ConA beads共同孵育15分鐘，通過(guò)包被刀豆蛋白的Con A beads與細(xì)胞核核膜的多糖結(jié)合，形成Con A beads與細(xì)胞核復(fù)合物，鏡檢ConA beads與細(xì)胞核的結(jié)合效果；或②不使用Con A beads，通過(guò)低速離心的方式，沉淀細(xì)胞核；

(5)細(xì)胞核與特異性抗體在室溫條件下共同孵育2小時(shí)，或4℃孵育過(guò)夜進(jìn)行一抗處理；

(6)結(jié)合了一抗的細(xì)胞核與相應(yīng)的特異性抗體進(jìn)行二抗處理，再次在室溫條件下共同孵育1小時(shí)；

(7)結(jié)合了特異性抗體的細(xì)胞核，與PA/G-Tn5轉(zhuǎn)座酶共同孵育；在抗體的精準(zhǔn)引導(dǎo)下，轉(zhuǎn)座酶靶向切割與特異性抗體互作的基因組DNA序列，并將接頭序列插入到DNA片段兩端；

(8)加入SDS、EDTA失活PA/G-Tn5轉(zhuǎn)座酶；加入Proteinase K，消化提取片段化的DNA；

(9)通過(guò)PCR擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)微量DNA測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建；

(10)測(cè)序文庫(kù)片段篩選，文庫(kù)濃度與片段分布檢測(cè)；

(11)高通量測(cè)序，得到DNA與特定蛋白的互作信息。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于動(dòng)物組織的裂解液在CUTTag中的使用方法，其特征在于，步驟(2)所述低濃度甲醛固定細(xì)胞核中DNA-蛋白質(zhì)之間的互作信息的方法為：細(xì)胞核鏡檢合格后，使用初始濃度為37％，終濃度為0.1％-0.2％的單分子甲醛，固定細(xì)胞核。