[發明專利]一種提高軟骨素-4-O-磺基轉移酶-1表達效率及酶活的方法

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• 申請號: 202210922651.0
• 申請日: 2022-08-02
• 公開（公告）號: CN115851560A
• 公開（公告）日: 2023-03-28
• 發明（設計）人: 張帆;劉立明;劉浩宇;宋偉;吳靜;齊俊平;劉佳
• 申請（專利權）人: 衢州益康園生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N9/10;C12N15/54;C12N15/70;C12P19/26;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發明公開了一種提高軟骨素?4?O?磺基轉移酶?1表達效率及酶活的方法，屬于生物工程技術領域。本發明通過將分子伴侶與軟骨素?4?O?磺基轉移酶?1共表達，提高了酶的可溶性表達，可使人源磺基轉移酶C4ST?1的酶活提高至103.4U/L，在20mg/mL底物的情況下，硫酸化程度達到了72％。本發明還通過優化發酵條件，使得共表達分子伴侶TF的重組大腸桿菌軟骨素?4?O?磺基轉移酶?1的酶活提高到了128.5U/L，硫酸化效率達到了78.5％，實現了磺基轉移酶酶活的大幅度提高，并且不影響酶的結構與后續純化，為酶法生產硫酸軟骨素提供了有效方法。

技術領域

本發明涉及一種提高軟骨素-4-O-磺基轉移酶-1表達效率及酶活的方法，屬于生物工程技術領域。

背景技術

人源軟骨素-4-O-磺基轉移酶-1(Chondroitin-4-O-sulfotransferase-1，C4ST-1；又名Carbohydrate sulfotransferase 11，CHST11)，能夠將來自3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸鹽(PAPS)的硫酸基團添加到不斷增長的多糖鏈中，催化與GlcA相連的GalNAc的4號位羥基硫酸化生成硫酸軟骨素A(CSA)。C4ST-1在真核和原核宿主中的表達均有報道，最初是在哺乳動物細胞COS和CHO細胞中得以成功表達，康振等在畢赤酵母中實現了人源C4ST-1的表達并具有一定酶活力，隨后在畢赤酵母中實現了以甲醇為碳源全生物法合成硫酸軟骨素；另外，Mattheos A.G.Koffas團隊通過構建代謝路徑在大腸桿菌K4菌株中首次實現了以原核細胞生產硫酸軟骨素。以上都證明了異源表達人源C4ST-1的可行性。

然而，人源C4ST-1在微生物中的異源表達仍然存在諸多問題，在真核微生物中，如酵母中表達酶活力較低，而在原核生物中由于缺乏翻譯后修飾，表達量過低。何文琴等設計了一個C4ST-1構建體，以其糖基化和非糖基化形式在大腸桿菌和畢赤酵母中表達，大腸桿菌表達的C4ST-1主要以不溶形式存在于包涵體中而畢赤酵母中的C4ST-1具有更高的總轉化率和優異的活性，但在存儲時不穩定。而在原核中表達時，仍然采用促融標簽、優化培養基組分、優化誘導條件(誘導劑濃度、誘導溫度)等，但是效果有限，只能實現低濃度的可溶性表達。因此，需要開發新的提高C4ST-1可溶性表達的方法。

發明內容

本發明提供了一種有效簡單、干擾性小且無需真核系統來實現人源磺基轉移酶C4ST-1高效表達及酶活力提高的方法，技術方案如下:

本發明提供了一種產人源軟骨素-4-O-磺基轉移酶-1的重組大腸桿菌，是將人源軟骨素-4-O-磺基轉移酶-1與分子伴侶通過質粒共表達。

在一種實施方式中，所述人源軟骨素-4-O-磺基轉移酶-1的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在一種實施方式中，編碼所述分子伴侶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3～8任一所示。

在一種實施方式中，所述質粒包括但不限于pET系列質粒、pRSFDuet系列質粒。

在一種實施方式中，所述重組大腸桿菌的宿主為E.coli Rosetta(DE3)。

在一種實施方式中，所述重組大腸桿菌以pET32a(+)表達所述人源軟骨素-4-O-磺基轉移酶-1，并以pRSFDuet-1表達所述分子伴侶。

本發明還提供了應用所述重組大腸桿菌發酵生產人源軟骨素-4-O-磺基轉移酶-1的方法。

在一種實施方式中，所述發酵是在TB培養基中發酵。

在一種實施方式中，利用IPTG誘導所述重組大腸桿菌產人源軟骨素-4-O-磺基轉移酶-1。

在一種實施方式中，所述誘導是將所述重組大腸桿菌培養至OD₆₀₀≥0.6。