[發明專利]一種具有高加帽效率的牛痘加帽酶突變體

有效

• 申請號: 202210918293.6
• 申請日: 2022-08-01
• 公開（公告）號: CN115927246B
• 公開（公告）日: 2023-08-22
• 發明（設計）人: 徐萬熙;鐘翼;高磊;冉曉園
• 申請（專利權）人: 愷佧生物科技（上海）有限公司
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16;C12N9/10;C12N15/55;C12N15/54;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 陸惠中

本發明提供一種具有高加帽效率的牛痘加帽酶突變體。通過蛋白結構建模分析，突變體表達篩選，將D1亞基中529–543無序序列替換，并在MTase結構域中引入了3個氨基酸突變，將His?tag融合在小亞基D12的C端，制備獲得了高純度的突變體加帽酶，經LC?MS質譜方法對mRNA加帽效率評價，該突變體具有比野生型加帽酶高14.4%的加帽效率。KCE?002突變體加帽酶適合工業應用GMP級別原料酶的生產。

技術領域

本發明涉及酶工程領域，尤其涉及一種具有高加帽效率的牛痘加帽酶突變體。

背景技術

牛痘病毒加帽酶?(Vaccinia?Capping?Enzyme)?能夠給體外轉錄合成的mRNA催化加上帽子結構(Cap0)，顯著改善mRNA的穩定性和翻譯效率,?成為mRNA疫苗生產中的一種關鍵原料酶。

牛痘病毒加帽酶由D1和D12兩個亞基組成，D1亞基含有RNA三磷酸酶（TPase）、鳥苷酰基轉移酶（GTase）和甲基轉移酶（G-N7?MTase）三個結構域。MTase需要與D12結合才能有效發揮作用。酶催化加帽過程，首先由RNA三磷酸酶（TPase）水解mRNA的5'γ-磷酸，產生5'β-磷酸。鳥苷轉移酶（GTase）以GTP為底物，形成共價酶-GMP中間體，將mRNA?5'端的β-磷酸與GMP結合形成5'-5'連接的Gppp-RNA?無甲基帽子結構。最后，甲基轉移酶（G-N7?MTase）以腺苷基蛋氨酸(AdoMet/SAM)為底物在鳥苷N7位置進行甲基化，形成Cap?0結構（m7GpppN）[1]。Cap?0結構可以在二氧甲基轉移酶（2'O-methyltransferase）的作用下進一步修飾成Cap?1（m7GpppmN）。

D1-(1–545)?包含TPase-GTase兩個結構域，其中529–543在晶體結構中是一段無序序列，連接C?端MTase?結構域?D1-(540–844)?。?MTase?中IHYSF?(681-685)，VLAIDFGNG(594-602)?兩段序列在多個物種中高度保守。?研究表明G600?是影響MTase催化功能的關鍵氨基酸，N550,?Y555,?F556,?R560,?R562,?N570,?K573,?K607,?Y608,?D676,?F679,H682,?E763這些氨基酸對MTase活性也有影響?。

牛痘病毒加帽酶D1/D12?雙亞基在大腸桿菌胞內共表達，通常將His?tag融合在大亞基D1亞基的N端，?然而D1亞基重組表達容易產生降解，第一步His?tag親和純化之后，D1/D12復合物雜帶較多，最終難以獲得高純度，高收率的加帽酶。

發明內容

本發明專利通過蛋白結構建模分析，突變體表達篩選，將D1亞基中529–543?無序序列替換為結構設計的linker序列GGLERGRGRGRGRSRGRGSAMGGS，并在MTase?結構域中引入了3個氨基酸突變?[Y668R]?[F669N]?[N753I]，將His?tag融合在小亞基D12?的C端，制備獲得了高純度的突變體加帽酶（KCE-002），經LC-MS質譜方法對mRNA加帽效率評價，該突變體具有比野生型加帽酶高14.4%的加帽效率。KCE-002突變體加帽酶適合工業應用GMP級別原料酶的生產。

本發明的第一個方面公開了一種牛痘加帽酶突變體，包括D1亞基和D12亞基，其特征在于：D1亞基的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:3所述，D12亞基的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:5所述。或與前述氨基酸序列同源性90%以上的序列。

上述的牛痘加帽酶突變體，其特征在于，D1亞基的基因序列如SEQ?ID?NO:4所述，D12亞基的基因序列如SEQ?ID?NO:6所述。或與前述氨基酸序列同源性90%以上的序列。

本發明的第二個方面公開了一種重組表達載體，其特征在于：包括所述的D1亞基和D12亞基的基因序列。

優選的，上述的重組表達載體，其特征在于：其為Kana+抗性。