[發(fā)明專利]一種Clusterin在肝硬化不同進(jìn)展階段的應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210897869.5
• 申請日: 2022-07-28
• 公開（公告）號(hào): CN115407069A
• 公開（公告）日: 2022-11-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王敏君;陳費(fèi);胡以平;劉清桂
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/92
• 分類號(hào): G01N33/92;A61K48/00;A61K38/17;A61P1/16;A61K49/00
• 代理公司: 重慶信必達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 50286
• 代理人: 劉竹

1.一種載脂蛋白Clusterin在制備肝硬化不同進(jìn)程的生物學(xué)診斷試劑盒中的應(yīng)用。

2.一種載脂蛋白Clusterin在制備用于慢性肝病抗纖維化藥物中的應(yīng)用。

3.一種血清中clusterin蛋白含量在作為判斷肝纖維化進(jìn)程的潛在血清診斷標(biāo)志物中的應(yīng)用。

4.一種鑒定載脂蛋白Clusterin在肝硬化不同進(jìn)展階段應(yīng)用的方法，其特征在于，所述鑒定載脂蛋白Clusterin在肝硬化不同進(jìn)展階段應(yīng)用的方法包括以下步驟：

步驟一，對(duì)肝纖維化發(fā)生過程中clusterin蛋白的表達(dá)變化特征進(jìn)行分析；

步驟二，確定Clu-/-基因敲除小鼠中肝纖維化發(fā)生各個(gè)時(shí)間段的特征變化；

步驟三，分析人clusterin重組蛋白在Clu-/-肝纖維小鼠中的作用；

步驟四，分析人clusterin重組蛋白在野生型肝纖維小鼠中的作用；

步驟五，AAV8-Clusterin過表達(dá)小鼠中評(píng)價(jià)clusterin蛋白對(duì)肝纖維化的作用。

5.如權(quán)利要求4所述鑒定載脂蛋白Clusterin在肝硬化不同進(jìn)展階段應(yīng)用的方法，其特征在于，所述步驟一中的分析肝纖維化發(fā)生過程中clusterin蛋白的表達(dá)變化特征包括：

(1)建立小鼠肝纖維化模型

腹腔注射ccl4試劑，每只小鼠注射2μL/g的ccl4試劑，每周注射2次，分別于造模2、4、6、8周收集小鼠肝臟組合和血清進(jìn)行檢測；通過HE、天狼星紅染色、Masson染色和血清羥脯氨酸含量判斷不同時(shí)間點(diǎn)肝臟纖維化程度；通過westernblot檢測COL-1、α-SMA蛋白表達(dá)水平確定不同肝纖維化程度下胞外蛋白基質(zhì)沉淀情況；

(2)clusterin蛋白在不同肝纖維化階段的表達(dá)變化

取纖維化造模2、4、6、8周的小鼠肝臟組織，通過clusterin蛋白的抗體染色，分析clusterin蛋白表達(dá)水平與肝纖維化進(jìn)展的相關(guān)性；通過肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞特異性標(biāo)志物如CK19、HNF4a與Clu蛋白抗體的共染色，判斷在纖維化發(fā)生過程中clusterin蛋白由哪些細(xì)胞產(chǎn)生以及產(chǎn)生的區(qū)域；

(3)clusterin蛋白在人肝硬化肝臟中的表達(dá)變化

取正常人和肝纖維化患者肝臟組織標(biāo)本，進(jìn)行原位clusterin蛋白的抗體染色和天狼猩紅染色，比較clusterin蛋白的表達(dá)變化。

6.如權(quán)利要求5所述鑒定載脂蛋白Clusterin在肝硬化不同進(jìn)展階段應(yīng)用的方法，其特征在于，所述步驟(1)中的ccl4試劑中的ccl4和橄欖油的比例為1：4。

7.如權(quán)利要求4所述鑒定載脂蛋白Clusterin在肝硬化不同進(jìn)展階段應(yīng)用的方法，其特征在于，所述步驟二中的確定Clu-/-基因敲除小鼠中肝纖維化發(fā)生各個(gè)時(shí)間段的特征變化包括：

與野生型小鼠一樣，建立Clu-/-小鼠肝纖維化模型，分別于造模2、4、6、8周收集小鼠肝臟組合和血清進(jìn)行檢測；采用肝纖維化相關(guān)標(biāo)志物檢測分析Clu-/-小鼠肝纖維化的發(fā)展進(jìn)程。

8.如權(quán)利要求4所述鑒定載脂蛋白Clusterin在肝硬化不同進(jìn)展階段應(yīng)用的方法，其特征在于，所述步驟三中的分析人clusterin重組蛋白在Clu-/-肝纖維小鼠中的作用包括：

(1)Clu-/-小鼠肝纖維化建模2周，隨機(jī)分成兩組；

(2)從肝纖維化建模開始，尾靜脈分別注射100μL生理鹽水和濃度為10μg/100μL的人重組clusterin蛋白，一周2次，共注射4次；

(3)建模2周后，收集肝臟組織和小鼠血清；通過HE、天狼星紅、Masson染色和血清羥脯氨酸含量分析人重組clusterin蛋白對(duì)肝纖維化逆轉(zhuǎn)的作用。