[發明專利]醛脫氫酶突變體及其在制備5-羥甲基-2-呋喃甲酸中的應用

在審

• 申請號: 202210886504.2
• 申請日: 2022-07-26
• 公開（公告）號: CN116024184A
• 公開（公告）日: 2023-04-28
• 發明（設計）人: 李冰峰;常思源
• 申請（專利權）人: 南京科技職業學院
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12P17/04;C12R1/19
• 代理公司: 南京匯盛專利商標事務所(普通合伙) 32238
• 代理人: 袁靜

本發明提供醛脫氫酶突變體及其在制備5?羥甲基?2?呋喃甲酸中的應用，屬于生物技術領域。該醛脫氫酶突變體，是將核苷酸序列如SEQ?ID?NO：2所示的醛脫氫酶第172位的氨基酸殘基突變為精氨酸后所得的突變體。本發明還提供包含所述編碼基因的重組表達載體、基因工程菌及其在制備5?羥甲基?2?呋喃甲酸中的應用。本發明通過蛋白質分子改造，顯著提高了來自銅綠假單胞菌（Pseudomonas?aeruginosa）PC?1的醛脫氫酶在E.coli?BL21(DE3)中全細胞轉化HMF的效率，在100?mM?HMF濃度下，突變體轉化效率是野生型醛脫氫酶的175%，具有很大的工業應用前景。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及醛脫氫酶突變體及其在制備5-羥甲基-2-呋喃甲酸中的應用。

背景技術

隨著化石資源的日益匱乏和環境問題的加劇，近年來生物基能源和平臺化合物的開發與利用越來越受到人們的關注。5-羥甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural，HMF)是一個重要的生物基平臺化合物，位居美國能源部宣布的“Top10+4”平臺化合物之列。該生物基平臺化合物可以通過碳水化合物脫水制備得到。5-羥甲基糠醛分子中有多個活性基團如羥基、醛基等，經化學修飾可轉化為各種高附加值中間體。這些HMF衍生物都是重要的合成中間體，在醫藥、能源和高分子等領域具有重要的應用價值。當前，化學催化仍是5-羥甲基糠醛高值化轉化的主流方法?；瘜W法通常以重金屬為催化劑，環境不友好。部分化學催化劑選擇性不理想，易產生副產物，影響后續目標產物分離純化。生物催化具有諸多優勢，如反應條件溫和、選擇性高、工藝簡單、無需利用有毒溶劑和催化劑，環境友好。

現有技術中，將5-羥甲基糠醛氧化為5-羥甲基-2-呋喃甲酸(5-methoxymethyl-2-furancarboxylic?acid，HMFCA)酶類，存在不能耐受較高的5-羥甲基糠醛濃度和催化效率較低的問題，限制了酶法轉化5-羥甲基糠醛的工業應用。

發明內容

本發明的目的是提供一種醛脫氫酶突變基因，該基因編碼的醛脫氫酶能耐受較高的HMF濃度、催化效率較高。

本發明的目的采用如下技術方案實現：

一種醛脫氫酶突變體，是將核苷酸序列如SEQ?ID?NO：2所示的醛脫氫酶第172位的氨基酸殘基突變為精氨酸后所得的突變體

本發明還提供所述突變體的編碼基因。

本發明還提供包含所述編碼基因的重組表達載體、基因工程菌。

本發明還提供所述重組表達載體、基因工程菌在制備5-羥甲基-2-呋喃甲酸中的應用。

在本發明中，采用所述基因工程菌的靜息細胞催化5-羥甲基糠醛制備5-羥甲基-2-呋喃甲酸。

與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：通過蛋白質分子改造，顯著提高了來自銅綠假單胞菌(Pseudomonas?aeruginosa)PC-1的醛脫氫酶在E.coli?BL21(DE3)中全細胞轉化HMF的效率，在100mM?HMF濃度下，突變體轉化效率是野生型醛脫氫酶的175％，具有很大的工業應用前景。

附圖說明

圖1誘導表達后的野生型醛脫氫酶PaALDH?70及其突變體的的SDS-PAGE電泳圖。其中M為分子量Marker，泳道1-6分別是：N168T、N168T、N168A、N168A、N168P、N168P；泳道7-12分別是L172R、L172R、L172N、L172N、L172F、L172F；泳道13-18分別是C302I、C302I、C302N、C302N、C302S、C302S；泳道19-24分別是T303N、T303N、T303E、T303E、T303A、T303A；泳道25-28分別是F467T、F467T、F467Y、F467Y。