[發(fā)明專利]耐高溫中性植酸酶突變體

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• 申請日: 2022-07-26
• 公開（公告）號(hào): CN115094049A
• 公開（公告）日: 2022-09-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鮑鍇;李馨培;吳秀秀
• 申請（專利權(quán)）人: 青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/16
• 分類號(hào): C12N9/16;C12N15/55;C12N15/81;C12N15/80;C12N1/19;C12N1/15;A23K20/189;A23K50/80;C12R1/84;C12R1/885
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本發(fā)明涉及基因工程與蛋白質(zhì)改造技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種耐高溫中性植酸酶突變體及其應(yīng)用。本發(fā)明以野生型植酸酶AN為基礎(chǔ)，提供了分別包含K121M、S181T和M241F單點(diǎn)突變的植酸酶突變體，其在80℃條件下處理5min后，酶活殘留率比野生型提高了26.1%?240.5%。從而說明，本發(fā)明提供的突變位點(diǎn)K121M、S181T、M241F能顯著提高植酸酶的耐熱性，有利于促進(jìn)其在水產(chǎn)飼料領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種耐高溫中性植酸酶突變體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

隨著全球水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，魚粉等優(yōu)質(zhì)動(dòng)物蛋白資源的緊缺已成為制約水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要因素。開發(fā)新的飼料資源，提高現(xiàn)有飼料資源的利用率，是飼料行業(yè)所面臨的重大問題。近年來，許多動(dòng)植物蛋白源被開發(fā)出來用以降低或取代魚粉的使用量，比如豆粕、菜粕、棉粕、肉骨粉、血粉等，其中植物蛋白源因其資源量大，價(jià)格低而廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)飼料中。然而與魚粉相比，這些植物蛋白源通常具有一種或多種方面的不足，如氨基酸組成不平衡，存在抗?fàn)I養(yǎng)因子(植酸、非淀粉多糖等)、適口性較差、消化率較低等，限制了植物蛋白源在水產(chǎn)飼料中的大量使用。為提高植物蛋白源的利用率，一些營養(yǎng)策略與技術(shù)已被開發(fā)并應(yīng)用于飼料工業(yè)中。利用發(fā)酵工程和基因工程等生物技術(shù)手段開發(fā)出的酶制劑，能夠提高飼料的利用率，在很大程度上緩解飼料資源緊缺的狀況。酶制劑因高效、安全、環(huán)保，符合資源節(jié)約型社會(huì)的要求而受到高度重視。

飼用酶制劑是從微生物、動(dòng)物、植物中提取的具有酶特性的一類物質(zhì)，其中微生物來源的酶制劑應(yīng)用最為廣泛。飼用酶制劑的種類很多，按照動(dòng)物自身能否合成，可分為消化酶和非消化酶。消化酶指動(dòng)物體內(nèi)能夠合成并分泌到消化道進(jìn)行消化的酶類，也稱內(nèi)源酶，主要包括淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶；非消化酶指動(dòng)物體自身通常不能合成酶類，也稱外源酶，包括植酸酶、纖維素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、果膠酶等。按照酶制劑的類型來分，可分為單一酶制劑和復(fù)合酶制劑。根據(jù)酶的作用底物，可分為蛋白酶、脂肪酶、碳水化合物酶、植酸酶等。

酶制劑應(yīng)用于飼料中，最大的關(guān)注點(diǎn)是其穩(wěn)定性，包括飼料加工中的溫度、水分、壓力對酶活性的影響，飼料貯存過程中酶活性的損失，酶進(jìn)入動(dòng)物消化道后，能否耐受胃酸的影響(有胃魚類)而到達(dá)小腸的作用部位。開發(fā)穩(wěn)定性的酶制劑一直是酶制劑工業(yè)努力的方向。可以采用穩(wěn)定化技術(shù)來提高酶的耐熱性，如物理包埋、化學(xué)修飾等方法；也可采用基因工程等生物技術(shù)手段，開發(fā)出穩(wěn)定的酶制劑，或在極端環(huán)境中尋求耐高溫微生物，產(chǎn)生耐高溫的酶。過去二十多年來，經(jīng)過多次的蛋白質(zhì)工程改造，飼用植酸酶耐溫性從不耐溫提升到到耐受85℃的技術(shù)進(jìn)步；但是還是不能滿足水產(chǎn)飼料的制備工藝要求。 因此，開發(fā)耐高溫（大于90℃）、作用pH中性且高產(chǎn)的植酸酶是開發(fā)水產(chǎn)植酸酶市場的關(guān)鍵。我國是水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，每年生產(chǎn)水產(chǎn)飼料2000萬噸以上，而且每年以10%速度增長。如果以每噸飼料添加2公斤植酸酶計(jì)算，其市場潛力為1萬噸；以50元/kg價(jià)格計(jì)算，則潛在市場產(chǎn)值為5億人民幣，市場潛力巨大。

但是，目前水產(chǎn)用植酸酶面臨耐溫性及耐中性環(huán)境差等制約因素。因此，利用基因工程和蛋白質(zhì)工程方法獲得耐高溫的商業(yè)化中性植酸酶成了亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)問題，提供了一種耐高溫中性植酸酶突變體及其應(yīng)用。所述突變體的耐熱性得到顯著提高，有利于促進(jìn)其在飼料領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明涉及一種植酸酶突變體，其包含與SEQ ID NO:1具有至少90%同一性的氨基酸序列，且與SEQ ID NO:1相比在選自下組中的至少一個(gè)位置上包含氨基酸的取代：121，181，241。

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述突變體的氨基酸序列與SEQ ID NO:1相比具有至少91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，或至少99%的同一性。