[發(fā)明專利]一種比率型電化學(xué)適配體傳感器的制備方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202210856605.5
• 申請日: 2022-07-21
• 公開（公告）號: CN115201296A
• 公開（公告）日: 2022-10-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李發(fā)蘭;郜曉琳;孫霞;郭業(yè)民;楊青青;張妍妍;孫志聰
• 申請（專利權(quán)）人: 山東理工大學(xué)
• 主分類號: G01N27/30
• 分類號: G01N27/30;G01N27/327;G01N27/48
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本發(fā)明屬于生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種可檢測牛奶中卡那霉素（KAN）的比率型電化學(xué)適配體傳感器制備及使用方法。本發(fā)明制備的比率型電化學(xué)適配體傳感器基于二茂鐵（Fc）標(biāo)記引物和石墨炔?亞甲藍(lán)（GDY?MB）納米復(fù)合材料。GDY?MB納米復(fù)合材料修飾在電極上會產(chǎn)生MB電信號，設(shè)計5'端標(biāo)記Fc的引物可以與適配體雜交形成互補雙鏈，當(dāng)KAN與適配體特異性結(jié)合后會釋放出游離引物形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致Fc接近電極表面引起Fc電信號增強(qiáng)。引入核酸外切酶I（Exo I）切割單鏈適配體以達(dá)到目標(biāo)物循環(huán)擴(kuò)增放大信號作用。引物3'端進(jìn)行磷酸化修飾以保護(hù)發(fā)夾結(jié)構(gòu)不被Exo I切割。進(jìn)一步修飾殼聚糖?氧化錫銻（CS?ATO）和AuNPs起到雙重信號放大作用，實現(xiàn)了卡那霉素的高靈敏檢測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明提供一種檢測牛奶中卡那霉素殘留的比率型電化學(xué)適配體傳感器的制備方法，屬于生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

卡那霉素（KAN）是一種重要的氨基糖苷類抗生素，已用于治療嚴(yán)重細(xì)菌感染和結(jié)核病，也被廣泛用于畜牧業(yè)中治療動物的各種疾病和作為動物生長促進(jìn)劑，然而，卡那霉素的濫用會造成在食品中殘留，通過食物鏈在人身體中積累，對人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，包括耳毒性、腎毒性、過敏反應(yīng)、甚至導(dǎo)致致病菌株產(chǎn)生抗生素耐藥性等，為了消費者的健康，歐盟（EU）已經(jīng)確定了牛奶中的卡那霉素最大殘留限（MRLs）為150 μg kg^-1，目前，食品中卡那霉素殘留的測定方法很多，包括毛細(xì)管電泳法（CE），薄層色譜法（TLC），高效液體色譜（HPLC）、氣體色譜-質(zhì)譜（LC-MS）、固相萃取（SPE）等，盡管這些分析方法對卡那霉素檢測是成功的，但它們存在一些限制，涉及樣品預(yù)處理繁瑣，耗時和價格昂貴等。

近些年，一些傳感器的報道，如適配體傳感器和免疫傳感器，為開發(fā)低成本、快速、簡單、選擇性好的檢測卡那霉素方法提供了方向，適配體（Apt）是一種在體外通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX）獲得的單鏈核酸識別元件，能夠識別和特異性結(jié)合細(xì)菌、金屬離子、農(nóng)獸藥和蛋白質(zhì)等多種目標(biāo)，其具有體外合成，高穩(wěn)定性、易于標(biāo)記和可定制結(jié)構(gòu)的獨特優(yōu)勢。電化學(xué)適配體傳感器通過Apt與換能器耦合產(chǎn)生電化學(xué)信號，由于其樣品使用量低、簡單、易于小型化等優(yōu)點，已經(jīng)開始成為越來越多的臨床診斷和食品分析研究的熱點，傳統(tǒng)的電化學(xué)適配體傳感器是基于在Apt修飾的電極上直接捕獲靶標(biāo)，由形成的Apt-靶標(biāo)復(fù)合物造成電信號變化進(jìn)行定量分析，然而這些方法往往靈敏度相對較低，為了獲得高靈敏度，實現(xiàn)對低水平分析物的準(zhǔn)確檢測，會采用不同的信號放大技術(shù)，然而在放大信號的過程中，由于環(huán)境變化、電極表面修飾Apt及其他材料密度的變化等會造成干擾，目前，提高靈敏度及增強(qiáng)抗干擾能力是電化學(xué)傳感器面臨的挑戰(zhàn)。

電極表面修飾導(dǎo)電性好的納米材料對提高電化學(xué)適配體傳感器的靈敏度起著至關(guān)重要的作用，納米摻雜氧化物中的氧化錫銻（ATO）由于其較好的穩(wěn)定性、低成本和良好的電導(dǎo)率，是一種很有前途的導(dǎo)電材料。納米金顆粒（AuNPs）具有如易制備、成本低、穩(wěn)定性高、優(yōu)良的生物相容性和電子特性等優(yōu)異特性，還可以作為固定探針分子的理想納米載體，進(jìn)一步提高傳感器性能。通過共價結(jié)合與被修飾巰基的Apt形成金硫鍵連接，或以極高的親和力與設(shè)計有連續(xù)腺嘌呤（polyA）的Apt吸附。polyA-Apt相較于硫化DNA，成本更低、能夠可控地調(diào)整DNA分子的密度。基于酶輔助實現(xiàn)信號放大技術(shù)，也是一種很有前途的新策略，核酸外切酶Ⅰ（Exo I）可以將單鏈DNA（ssDNA）從3’端依次水解成單核苷酸，進(jìn)而釋放靶標(biāo)實現(xiàn)目標(biāo)物循環(huán)重復(fù)利用，實現(xiàn)信號放大，由于不需要特異性的識別序列，非常適合構(gòu)建通用的生物傳感平臺。