[發明專利]一種小鼠頸動脈血管組織單細胞懸液的制備方法及其應用

在審

• 申請號: 202210837887.4
• 申請日: 2022-07-16
• 公開（公告）號: CN115141792A
• 公開（公告）日: 2022-10-04
• 發明（設計）人: 朱力;李豐產;唐朝君;杜赟
• 申請（專利權）人: 蘇州大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12Q1/6869
• 代理公司: 北京博識智信專利代理事務所(普通合伙) 16067
• 代理人: 湯敏妮

本發明公開一種小鼠頸動脈血管組織單細胞懸液的制備方法，將小鼠頸動脈組織剪碎后加入解離工作液RA消化1小時，然后離心去除上清后，再加入解離工作液RB，最終離心獲得高質量的單細胞懸液。本發明還提供了一種利用所述的制備方法在單細胞測序和流式檢測相關領域中的應用。本發明的有益效果：本發明提供了一種用于單細胞測序的小鼠頸動脈血管組織單細胞懸液制備方法及應用，具體涉及使用多種類型組織消化酶對小鼠頸動脈組織進行分步式消化從而把控組織解離程度以獲得高質量的單細胞懸液進行單細胞測序，從而大幅增加單細胞測序和流式檢測技術的可行性與精確性，推動多種疾病的臨床診斷和理論機制研究，該發明具有重要的應用前景和推廣價值。

技術領域

本發明屬于生物醫學技術領域，具體涉及一種小鼠頸動脈血管組織單細胞懸液的制備方法及其應用。

背景技術

近年來，隨著測序技術的高速發展，用于揭示細胞異質性的單細胞轉錄組測序技術如10×Genomics等應運而生。其在單細胞水平對RNA進行高通量測序和分析，檢測細胞全基因組范圍內所有基因的表達情況，在腫瘤、神經發育、心血管疾病和免疫學等領域均得到了一定的運用。進行單細胞測序往往需要將實體組織解離成高質量的單細胞懸液，然而，由于不同的組織具有不同的生理特性，所以在使用常規解離方法制備單細胞懸液時常常出現細胞活率低、細胞數量少，細胞碎片多等影響單細胞捕獲的多種問題。因此，發明針對不同組織的消化方法，制備高質量的單細胞懸液在腫瘤和心血管等研究領域中具有重要意義。

目前常使用酶消化法即用膠原酶或者彈性蛋白酶等對小鼠血管組織進行單細胞懸液的制備。其通過對組織中的彈性纖維和膠原纖維進行降解，進而破壞細胞與細胞間負責緊密連接的蛋白，從而達到解離細胞的目的。然而，不同的組織具有不同的生理特性，以往的發明專利如CN111621466A和CN107748130A等是針對小鼠心臟和肺動脈等組織的單細胞懸液制備，而專門針對小鼠頸動脈血管組織的消化方法還尚未有報道。

現有技術往往采取單一的解離方式且很難在小鼠頸動脈組織的消化中發揮良好的作用。單純同時使用如膠原酶或者胰蛋白酶對組織進行消化很難實時掌控細胞消化的效果，容易造成細胞消化不徹底或者細胞消化過度，從而導致單細胞懸液制備的失敗，因此發明一種使用多種類型酶進行分步式消化的方法將有利于獲得高質量的單細胞懸液，從而大幅增加單細胞測序和流式檢測技術的可行性與精確性，推動多種疾病的臨床診斷和理論機制研究。

發明內容

為解決以上現有技術的缺點，本發明提供一種小鼠頸動脈血管組織單細胞懸液的制備方法及其應用。本發明通過以下技術方案實現。

一種小鼠頸動脈血管組織單細胞懸液的制備方法，包含如下過程：

S1：小鼠麻醉后使用預冷的PBS進行心臟灌流，剔除頸動脈周圍組織；

S2：將頸動脈縱向剖開，放入含1.5％FBS的六孔板中；

S3：用手術剪刀將每根頸動脈血管剪成約為2mm²的4段，吸入1.5mL EP管中，2000rpm離心5分鐘以沉淀血管組織；

S4：用HBSS溶液配制1mL組織解離RA工作液；

S5：每管加入500μL解離工作液，放入37℃水浴鍋中加熱解離1小時；

S6：每間隔10分鐘使用1mL移液槍吹打一次；

S7：1小時后加入500μL 5％FBS混勻，使用40μm濾器進行過濾；

S8：放入離心機中，1000rpm離心5分鐘；

S9：吸棄上清后加入200μL組織解離RB工作液；

S10：放入37℃水浴鍋消化5分鐘，期間每隔1分鐘輕輕吹打一次；

S11：使用200μL 5％FBS終止消化，1000rpm離心5分鐘；