[發(fā)明專(zhuān)利]脫細(xì)胞人羊膜的制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210835190.3
• 申請(qǐng)日: 2022-07-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN115105636A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-09-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 章詩(shī)瑤;張宇;榮耀星;于艷秋
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 沈陽(yáng)匯智細(xì)胞產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新研究院有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): A61L27/36
• 分類(lèi)號(hào): A61L27/36;A61L27/60;A61L15/42;A61L15/40
• 代理公司: 沈陽(yáng)冠君專(zhuān)利代理事務(wù)所(普通合伙) 21271
• 代理人: 金慧君

本發(fā)明公開(kāi)了一種脫細(xì)胞人羊膜的制備方法，包括以下步驟：(1)取新鮮的人羊膜，浸泡于初步消毒溶液中；(2)依次用無(wú)菌水、次氯酸鈉溶液、無(wú)菌水清洗；(3)浸入凍存溶液中，撈出，反復(fù)凍融兩次；(4)置于TritonX?100溶液中，搖床孵育，初步去除細(xì)胞；然后用PBS溶液震蕩清洗羊膜；(5)置于脂肪酶溶液中，搖床孵育，以充分去除上皮細(xì)胞及其他雜質(zhì)，然后用PBS溶液震蕩清洗羊膜；(6)將羊膜平鋪在硝酸纖維膜上，冷凍；(7)冷凍干燥至含水量為5％～7％。本發(fā)明的脫細(xì)胞人羊膜的制備方法，不使用物理方法刮擦羊膜，保證了原有的重要細(xì)胞因子含量，維持了組織學(xué)結(jié)構(gòu)，無(wú)細(xì)胞毒性，DNA含量符合脫細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種脫細(xì)胞人羊膜的制備方法，屬于生物材料處理技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

人羊膜是一張半透明薄膜，位于胎盤(pán)最內(nèi)層，總厚度0.02～0.5mm，結(jié)構(gòu)共五層，包括上皮細(xì)胞層、基底膜層、致密層、成纖維細(xì)胞層、海綿層。羊膜沒(méi)有神經(jīng)、淋巴管和血管，具有低免疫原性，能抑制白細(xì)胞與細(xì)菌浸潤(rùn)，抑制相應(yīng)蛋白酶，具有多種因子，這些特性使羊膜被多個(gè)臨床科室應(yīng)用。然而，新鮮羊膜在安全性、存儲(chǔ)等方面仍具有挑戰(zhàn)，研發(fā)人員一直在研究穩(wěn)定的脫細(xì)胞方法。脫細(xì)胞化過(guò)程是去除所有的細(xì)胞，降低免疫原性和炎癥的同時(shí)保留基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的主要成分，使脫細(xì)胞羊膜成為一種新型、可靠的生物材料，以用作各種器官和組織修復(fù)的支架。

成人皮膚和組織受損后，會(huì)進(jìn)行自我修復(fù)，但由于缺乏維持正常皮膚彈性的膠原纖維網(wǎng)絡(luò)及生長(zhǎng)因子，愈合后的傷口只能達(dá)到其原始組織強(qiáng)度的70％。脫細(xì)胞人羊膜含有表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)、血管EGF(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGFs)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)和許多已知的趨化因子，以及Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型膠原、粘連蛋白、層粘連蛋白，這些生長(zhǎng)因子及蛋白可以發(fā)揮上皮化作用，有利于傷口的愈合，因此脫細(xì)胞人羊膜對(duì)急性和慢性傷口的愈合都很重要，也能提高患處皮膚移植成功率。

中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利CN 105797212 A公開(kāi)了一種用于皮膚難愈合創(chuàng)面修復(fù)的脫細(xì)胞羊膜制備方法及應(yīng)用，該脫細(xì)胞方法涉及到胰蛋白酶與核酸酶，會(huì)降解ECM成分和生長(zhǎng)因子，導(dǎo)致羊膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響創(chuàng)傷的修復(fù)效果。中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利CN 110946879 A公開(kāi)了一種包含疏松層的脫細(xì)胞生物羊膜及其制備方法，使用過(guò)氧乙酸進(jìn)行病毒滅活，過(guò)氧乙酸性質(zhì)不穩(wěn)定，易分解，在稀釋時(shí)很難控制濃度。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種脫細(xì)胞人羊膜的制備方法。本發(fā)明的方法不使用物理方法刮擦羊膜，結(jié)合低溫和表面活性劑方法，優(yōu)化低溫冷凍操作，減少冰晶形成，保護(hù)羊膜結(jié)構(gòu)和基質(zhì)完整。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種脫細(xì)胞人羊膜的制備方法，包括以下步驟：

(1)取新鮮的人羊膜，浸泡于初步消毒溶液中(浸泡時(shí)間20分鐘)，對(duì)羊膜進(jìn)行初步消毒，并抑制細(xì)菌生長(zhǎng)；

所述初步消毒溶液為含有50μg/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素和2.5μg/ml兩性霉素的PBS溶液；

(2)取出羊膜，用無(wú)菌水清洗(4次，每次10分鐘)，再用濃度為0.05％的次氯酸鈉溶液清洗10分鐘(次氯酸鈉滅活病毒，對(duì)羊膜無(wú)損傷)，再用無(wú)菌水清洗(4次，每次10分鐘)；

進(jìn)一步地，清洗過(guò)程中進(jìn)行搖床震蕩，羊膜會(huì)隨晃動(dòng)而充分展開(kāi)，清洗效果更佳；

(3)將清洗后的羊膜浸入凍存溶液中，撈出置于濾紙上，充分展開(kāi)，再覆蓋一層濾紙，置于-80℃環(huán)境下凍存1小時(shí)，然后置于37℃環(huán)境下融化0.5小時(shí)，再置于-80℃環(huán)境下凍存1小時(shí)，然后置于37℃環(huán)境下融化0.5小時(shí)(即反復(fù)凍融2次)，以破壞細(xì)胞壁，且凍融次數(shù)少，甘油可以減少冰晶損傷，濾紙能吸走部分水分；