[發明專利]效價可控的噬菌體輔助進化方法

有效

• 申請號: 202210830008.5
• 申請日: 2022-06-30
• 公開（公告）號: CN115074377B
• 公開（公告）日: 2023-03-24
• 發明（設計）人: 羅元廷;江翱;張志乾;吳奕瑞;胡玉成;劉麗花
• 申請（專利權）人: 廣州市乾相生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N7/01;C12N15/54;C12N15/33;C12R1/92
• 代理公司: 蘇州根號專利代理事務所(普通合伙) 32276
• 代理人: 項麗

1.一種MBP-PANCE噬菌體輔助進化方法，其特征在于其步驟包括：

（1）構建噬菌體進化系統，包括攜帶待進化目標基因的噬菌體M13、宿主菌一以及宿主菌二，

所述噬菌體M13的gIII基因被切除，所述宿主菌一中含有增殖輔助質粒pJC175e，所述增殖輔助質粒pJC175e攜帶gIII基因，在噬菌體M13進入含有pJC175e的宿主菌一后，啟動gⅢ基因；

所述宿主菌二中含有誘導突變的質粒DP6+，所述誘導突變的質粒DP6+攜帶突變誘導基因、gⅢ基因，以及與gⅢ基因耦合的引導待進化目標基因表達的基因，阿拉伯糖啟動子啟動所述突變誘導基因的表達，該gⅢ基因受tet操縱子操縱；

（2）將攜帶待進化目標基因的噬菌體M13轉化到宿主菌一中，加入宿主菌二，獲得初代進化液，添加誘導劑進行誘導突變一段時間后，在初代進化液中添加tet使gIII基因表達，進行噬菌體包裝，獲得初代包裝液；取二代進化液的菌液加入宿主菌二，獲得二代進化液，重復上述誘導突變-包裝的過程，以獲得相較于初始的噬菌體M13效價滴度更高的突變體。

2.根據權利要求1所述的MBP-PANCE噬菌體輔助進化方法，其特征在于，所述目標基因為T7RNA聚合酶，所述引導待進化目標基因表達的基因為T7 promoter。

3.根據權利要求1所述的MBP-PANCE噬菌體輔助進化方法，其特征在于，所述目標基因為內含肽，所述引導待進化目標基因表達的基因為內含肽C端氨基酸的編碼基因。

4.根據權利要求1所述的MBP-PANCE噬菌體輔助進化方法，其特征在于，所述DP6+攜帶的突變誘導基因為DNAQ926、dam、seqA、emrR、UGI、PmCDA1基因。

5.根據權利要求1所述的MBP-PANCE噬菌體輔助進化方法，其特征在于，步驟（2）中在進行誘導突變前，先對進化液進行效價滴定，使進化液的滴度控制在10⁶~10⁷ pfu/ml。

6.一種AP- PANCE噬菌體輔助進化方法，其特征在于其步驟包括：

（1）構建噬菌體進化系統，包括攜帶待進化目標基因的噬菌體M13、宿主菌一以及宿主菌三，

所述噬菌體M13的gIII基因被切除，所述宿主菌一中含有增殖輔助質粒pJC175e，所述增殖輔助質粒pJC175e攜帶gIII基因，在噬菌體M13進入含有pJC175e的宿主菌一后，啟動gⅢ基因；

所述宿主菌三中含有增殖輔助質粒pJC175e+和誘導突變的質粒DP6+，所述增殖輔助質粒pJC175e+攜帶耦合的gIII基因以及引導待進化目標基因表達的基因，所述誘導突變的質粒DP6+攜帶突變誘導基因、gⅢ基因，以及與gⅢ基因耦合的引導待進化目標基因表達的基因，阿拉伯糖啟動子啟動所述突變誘導基因的表達，該gⅢ基因受tet操縱子操縱；

（2）將攜帶待進化目標基因的噬菌體M13轉化到宿主菌一中，加入宿主菌三，獲得初代進化液，添加誘導劑進行誘導突變一段時間后，在初代進化液中添加tet使gIII基因表達，進行噬菌體輔助包裝，獲得初代輔助包裝液；取初代輔助包裝液的菌液加入宿主菌三，獲得二代進化液，重復上述誘導突變-輔助包裝的過程，以獲得相較于初始的噬菌體M13效價滴度更高的突變體。

7.根據權利要求6所述的AP- PANCE噬菌體輔助進化方法，其特征在于，所述目標基因為T7RNA聚合酶，所述引導待進化目標基因表達的基因為T7 promoter。

8.根據權利要求6所述的AP- PANCE噬菌體輔助進化方法，其特征在于，所述目標基因為內含肽，所述引導待進化目標基因表達的基因為內含肽C端氨基酸的編碼基因。

9.根據權利要求6所述的AP- PANCE噬菌體輔助進化方法，其特征在于，所述DP6+攜帶的突變誘導基因為DNAQ926、dam、seqA、emrR、UGI、PmCDA1基因。