[發明專利]線粒體異檸檬酸脫氫酶的活性檢測系統及其應用

有效

• 申請號: 202210828923.0
• 申請日: 2022-07-15
• 公開（公告）號: CN114908139B
• 公開（公告）日: 2022-10-04
• 發明（設計）人: 賈映彤;鄭振慧;王旭;張騫豐;鄭豪亮;馬玉嶺
• 申請（專利權）人: 北京索萊寶科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/32
• 分類號: C12Q1/32
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 金田蘊

本發明公開了一種線粒體異檸檬酸脫氫酶的活性檢測系統及其應用。系統包括：提取液一：包括蔗糖、乙二胺四乙酸二鈉、氯化鈉、牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮和緩沖液一；提取液二：包括蛋白酶抑制劑溶液；提取液三：包括表面活性劑和緩沖液一；試劑一：包括氯化鎂、異檸檬酸和緩沖液一；試劑二：包括煙酰胺腺嘌呤雙核苷酸、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、牛血清白蛋白、疊氮鈉、乙二胺四乙酸二鈉和蒸餾水；試劑三：包括2,4?二硝基苯肼、鹽酸和蒸餾水；試劑四：包括水溶性無機堿和蒸餾水；標準品：包括α?酮戊二酸和蒸餾水；以及分光光度計或者酶標儀。本發明系統還具有準確度、精密度高、穩定性好等優勢。

技術領域

本發明涉及生化檢測領域，具體而言，涉及一種線粒體異檸檬酸脫氫酶的活性檢測系統及其應用。

背景技術

異檸檬酸脫氫酶是參與三羧酸循環最重要的酶之一，其催化異檸檬酸轉化為α-酮戊二酸，是在三羧酸循環酶促反應中的限速步驟。根據異檸檬酸脫氫酶的2種輔酶-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP），分為NAD-依賴性異檸檬酸脫氫酶和NADP-異檸檬酸脫氫酶，其中，線粒體異檸檬酸脫氫酶為NAD-依賴性異檸檬酸脫氫酶，只存在于真核細胞里。

線粒體異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase, ICDHm），廣泛存在于動物、植物的線粒體中，與線粒體基因表達及線粒體其他的功能有關，對生物體的整個生物的生命代謝有很大影響。其表達活性需要二價金屬離子的參與，如鎂離子、錳離子、鐵離子、鑷離子、鋅離子和鈷離子等金屬離子，離子半徑決定了反應效率，其中錳離子和鎂離子是天然的配體，鈣離子是抑制劑。

目前檢測ICDHm的方法是NAD和異檸檬酸會被ICDHm催化生成NADH和α-酮戊二酸，通過檢測NADH的生成量來計算酶活。但是NADH的變化通常比較小，尤其是當樣本酶活性較小時，很容易發生逆反應或其他反應而產生負值變化。此反應物無顏色變化，無法從顏色變化上判斷酶活。

發明內容

本發明旨在提供一種線粒體異檸檬酸脫氫酶的活性檢測系統及其應用，以提供一種準確、便捷測定線粒體異檸檬酸脫氫酶活性的方法。

為了實現上述目的，根據本發明的一個方面，提供了一種線粒體異檸檬酸脫氫酶的活性檢測系統。該活性檢測系統包括： 提取液一：包括蔗糖、乙二胺四乙酸二鈉、氯化鈉、牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮和緩沖液一；提取液二：包括蛋白酶抑制劑溶液；提取液三：包括表面活性劑和緩沖液一；試劑一：包括氯化鎂、異檸檬酸和緩沖液一；試劑二：包括煙酰胺腺嘌呤雙核苷酸、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、牛血清白蛋白、疊氮鈉、乙二胺四乙酸二鈉和蒸餾水；試劑三：包括2,4-二硝基苯肼、鹽酸和蒸餾水；試劑四：包括水溶性無機堿和蒸餾水；標準品：包括α-酮戊二酸和蒸餾水；以及分光光度計或者酶標儀，設置為檢測505nm下的吸光度。

進一步地，提取液一由0.1~0.5g蔗糖、1~5 mg 乙二胺四乙酸二鈉、0.1~1g 氯化鈉、0.01~0.1g 牛血清白蛋白、0.1~1g 聚乙烯吡咯烷酮和50mL pH為7.0~7.4之間的緩沖液一組成。

進一步地，提取液二包括選自由苯甲基磺酰氟、乙二胺四乙酸二鈉、亮抑蛋白酶肽、抑糜朊酶素、(3S)-7-氨基-1-氯-3-磺酰氨基-2-庚酮鹽酸鹽和L-1，4'-甲基磺酰基-2-苯基乙基氯甲基酮組成的組中的一種或多種，濃度為0.1~1mol/L。

進一步地，提取液三由10~50μL表面活性劑和50mL pH為7.0~7.4之間的緩沖液一組成；表面活性劑為曲拉通X-100、吐溫80和聚乙二醇中的一種或多種。

進一步地，試劑一由10~20mg氯化鎂、2~20mg異檸檬酸和50mL pH為7.0~7.4之間的緩沖液一組成。

進一步地，緩沖液一為 pH值為中性的緩沖液，優選為三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液、磷酸鹽緩沖液或4-羥乙基哌嗪乙磺酸溶液；更優選的，緩沖液一為0.01~0.1M三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液。