[發(fā)明專利]一種耐高溫木聚糖酶突變體及其應用

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• 申請日: 2022-07-12
• 公開（公告）號: CN115029335A
• 公開（公告）日: 2022-09-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鮑鍇;李馨培;吳秀秀
• 申請（專利權(quán)）人: 青島蔚藍生物集團有限公司
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/56;C12N15/81;C12N1/19;A23K20/189;C12R1/84
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本發(fā)明涉及基因工程與蛋白質(zhì)改造技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種耐高溫木聚糖酶突變體及其應用。本發(fā)明以野生型木聚糖酶PT為基礎(chǔ)，提供了包含T23S，S39D，T41N，S62Q，L64M，W116V，A139G，Y144F，T149F，N160E/V中至少一個突變位點的突變體。與野生型相比，在95℃條件下處理5min后，所述木聚糖酶單點突變體的酶活殘留率提高了10.0%?25.6%，耐熱性顯著增強；其中，含L64M單點突變的木聚糖酶突變體的耐熱性最強，酶活殘留率高達87.90%，有利于其在飼料領(lǐng)域的廣泛應用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種耐高溫木聚糖酶突變體及其應用。

背景技術(shù)

木聚糖是一種多聚五碳糖，其主要成分是D-木糖，其主鏈是由β-(1-4)-吡喃型D-木糖單元通過β-l,4-糖苷鍵連接而成的多聚合物，大部分木聚糖是異型多糖，其主鏈常含有阿拉伯糖、香豆酸，等支鏈含有多種替代糖基，常見的有阿魏酸、糖醛酸等。因為木聚糖支鏈的殘基與木質(zhì)素、果膠、葡聚糖等連接的原因，所以木聚糖很難被降解。木聚糖在降解的過程中，木聚糖酶起到了重要作用，由于它能打開木聚糖的主鏈和支鏈，并將木聚糖分解為可發(fā)酵的低聚糖或者單糖，以利于生物的利用。

木聚糖酶（endo-1,4-β-D-xylanxylanohydrolase EC3.2.1.8）是一種水解酶，是指一類能將木聚糖降解為低聚木糖或木糖的復合酶系，通常包含內(nèi)切酶和外切酶。一般所說的木聚糖酶即內(nèi)切β-1,4-D-木聚糖酶（EC3.2.1.8），主要作用于木聚糖的主鏈骨架的降解，水解產(chǎn)物主要為木二糖或木二糖以上的低聚糖，也有少量的木糖、阿拉伯糖和甘露糖，被認為是木聚糖降解過程中最為關(guān)鍵的酶之一。根據(jù)木聚糖酶作用pH的不同可以將木聚糖酶分為嗜酸性酶、嗜堿性酶和中性酶。也可根據(jù)對溫度的不同而分為嗜熱酶、中溫酶和低溫酶。

木聚糖酶的來源非常廣泛，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的能產(chǎn)木聚糖酶的微生物將近有幾十個屬，一百多個種，包括細菌、真菌、放線菌以及某些酵母等。目前已經(jīng)被報道的細菌有Butyrivibro、Clostridium；真菌類的有Penicillium、Trichoderma、Aspergillus等。放線菌類的Streptomyces sp.、Streptomyces flavogriseus、Pseudomonos等；酵母類的有Cryptococcus albidus，不同種類的微生物產(chǎn)生不同類型的木聚糖酶，同一種微生物也可以產(chǎn)生不同的木聚糖酶。

由于木聚糖酶在木聚糖降解過程中的重要作用，因此木聚糖酶已被廣泛應用于各種行業(yè)中，如：紙漿工業(yè)、動物飼料、食品行業(yè)、能源行業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)、紡織等行業(yè)領(lǐng)域。盡管從動物、植物和微生物中都可以獲得木聚糖酶，然而目前主要是依靠對真菌和細菌等微生物的發(fā)酵獲得大量的木聚糖酶。酸性木聚糖酶在pH值4.0以下時仍然保持較高酶活性，通常酸性木聚糖酶可以廣泛應用于飼料工業(yè)、釀酒工業(yè)、食品工業(yè)等眾多領(lǐng)域，充分顯示出它在生產(chǎn)上的巨大潛力。

但是，目前木聚糖酶面臨產(chǎn)量低、成本高、耐溫性及耐酸性酶難獲得等制約因素。因此，利用基因工程和蛋白質(zhì)工程方法獲得高產(chǎn)量、低成本適用于商業(yè)化的新型木聚糖酶成了亟待解決的問題。時號等以Pseudothermotoga thermarum DSM 5069木聚糖酶的氨基酸序列為模版，通過分析耐熱木聚糖酶的氨基酸偏好性與引入優(yōu)化分子內(nèi)相互作用的策略，引入二硫鍵，優(yōu)化酶內(nèi)電荷的相互作用，剛化酶的活性中心，提供了一種具有極強的耐熱性能和酸性pH條件下高活性的木聚糖酶，該木聚糖酶在95℃、pH為5.5的條件下酶活性最高，其耐熱性能80℃提高到了95℃。史寶軍篩選到了一株嗜酸真菌Bisporasp.X-1，其產(chǎn)生的木聚糖酶最適pH值為2.6，在pH2～4的范圍內(nèi)維持50％以上的酶活性；最適溫度為65℃，在60℃下保溫60min，酶活性基本維持不變，70℃下保溫15min，剩余酶活性為90％以上，處理60min后，酶活仍在70％以上；用胃蛋白酶和胰蛋白酶處理60分鐘，酶活性維持在85～100％。