[發(fā)明專利]一種耐受血液或者血液制品抑制的Taq DNA聚合酶突變體及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210723212.7
• 申請日: 2022-06-24
• 公開（公告）號: CN114958800B
• 公開（公告）日: 2023-08-25
• 發(fā)明（設計）人: 齊欣;陳相永;宋新文;耿亮;辛文
• 申請（專利權）人: 北京脈道生物藥品制造有限公司;北京全式金生物技術股份有限公司
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/54;C12Q1/686
• 代理公司: 北京正理專利代理有限公司 11257
• 代理人: 趙曉丹

本發(fā)明公開一種耐受血液或者血液制品抑制的Taq?DNA聚合酶突變體及其應用。首先公開Taq?DNA聚合酶突變體在SEQ?ID?NO.1所示的序列，具有下述的一個或多個氨基酸位置上的氨基酸取代，各取代用三聯體表示：字母?數字?字母，其中數字表示突變氨基酸的位置，數字前的字母對應突變涉及的氨基酸，數字后的字母表示用于置換數字前氨基酸的氨基酸：Y81H、K82N、V310I、L619A。進一步公開其在包含血液或血液制品的樣品體系的PCR領域中的應用。本發(fā)明Taq?DNA聚合酶突變體改變了構象，提高其在PCR體系中對血液的耐受能力，可用于血液直擴PCR，簡化了操作步驟，具有廣闊的應用前景。

技術領域

本發(fā)明涉及生物技術領域。更具體地，涉及一種耐受血液或者血液制品抑制的TaqDNA聚合酶突變體及其應用。

背景技術

PCR(Polymerase?Chain?Reaction)技術是用來放大擴增特定DNA片段的分子生物學技術，自1986年被提出以來，分子生物學及其它相關學科依賴于此技術迅速發(fā)展。TaqDNA聚合酶是第一代熱穩(wěn)定性的聚合酶，它解決了大腸桿菌聚合酶耐熱性差、每次反應后都要補充的缺點，完成了DNA的自動擴增，使PCR技術變成了一種便利、普遍實用的分子生物學技術。

隨著分子生物學技術的發(fā)展，PCR技術已被廣泛應用于基因表達、分子克隆、測序、疾病檢測和治療、法醫(yī)學調查、農業(yè)生物學技術等過程中，檢測的基因模板可能來自于人體或動物體組織、唾液、糞便、痰液或土壤中，因其模板的復雜性，提取模板往往步驟繁多，操作復雜，也可能會引入污染，造成假陰性或假陽性，對于實驗影響很大，因此，用樣本作為模板直接進行擴增是逐漸成為較為主流的測試方法。在宏基因組擴增實驗中，樣品與環(huán)境中可能帶來一些污染與化學制劑影響，導致擴增效果不理想；另外，血液及組織樣品中也存在一些抑制物對聚合酶活性也存在抑制作用，因此，直擴的方法對于DNA聚合酶的抗抑制性有較高的要求，野生型Taq?DNA聚合酶在此類PCR實驗中表現不穩(wěn)定。

Taq?DNA聚合酶屬于聚合酶家族A，是一個單體酶，全長832個氨基酸，與大腸桿菌聚合酶I有很高的結構同源性。目前野生型Taq?DNA聚合酶對于全血的耐受濃度為0.1～1％，它的N端截短體Klentaq對于血液的耐受程度有一定的提升。但是Klentaq的耐受力仍然不能滿足直擴試劑盒的需求，因此我們需要對野生型聚合酶進行突變，提升聚合酶對全血的耐受程度。

酶進化是指利用定向進化技術對工具酶進行改造，旨在提高酶的催化活力、酶的穩(wěn)定性及對環(huán)境的適應能力。定向進化是通過模擬酶在自然界中的進化方法，在核酸序列上引入隨機突變，獲得突變體文庫。通過定向選擇的方法，篩選出性質得到優(yōu)化的目標酶。目前對于突變體文庫的篩選主要采用分級篩選法和高通量篩選法，主要采用平板或多孔篩選板為主要篩選工具，常用HPLC測定酶活或酶標儀進行光譜分析進行篩選，篩選通量較小。定向進化的突變文庫模擬自然界的進化過程，往往會構將龐大的突變體文庫。傳統的篩選方式相對于較大的篩選文庫意味著巨大的工作量和較低的篩選效率。

同時，聚合酶更加不適用于上述兩種篩選方法。不同于聚合酶，其他催化酶底物與產物成分較為均一，通過熒光光譜可以直接檢測底物活性從而檢測酶活。聚合酶的底物與產物都不能通過簡單的一步法進行測量，所以不能直觀得到酶活數據，因此需要特殊的方法對酶活進行檢測。分隔式自我復制(Compartmentilized?Self-Replication,CSR)技術是針對聚合酶的高通量篩選技術，主要原理是將聚合酶在大腸桿菌系統中表達出來，采用油包水乳化液體系將細菌菌體分離，油包水體系中包含有復制所需的緩沖環(huán)境與底物，但不另外添加聚合酶與模板，根據聚合酶序列設計引物，使每一個油包水液滴形成一個微型PCR體系。油包水體系分離、分散且穩(wěn)定，微型體系之間不會相互影響，聚合酶只復制自身的編碼基因，形成一個環(huán)路反饋。在這個復制過程中，沒有活性的突變體酶不能對自我復制進行催化，有催化活性的突變體則將自身DNA通過鏈式聚合反應指數級放大，在后續(xù)的產物收集過程中被富集到。CSR技術的優(yōu)勢在于單次可篩選大量的有活性的聚合酶突變體，其篩選通量可達10⁹個/樣品。