[發明專利]一種mRNA的分離純化方法

在審

• 申請號: 202210722756.1
• 申請日: 2022-06-21
• 公開（公告）號: CN114907430A
• 公開（公告）日: 2022-08-16
• 發明（設計）人: 蘇志國;李正軍;張松平;馮雪;林旋
• 申請（專利權）人: 中國科學院過程工程研究所
• 主分類號: C07H21/02
• 分類號: C07H21/02;C07H1/06
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 王艷齋

本發明提供了一種mRNA的分離純化方法，所述mRNA的分離純化方法包括將待分離純化的mRNA原料經過兩次疏水層析進行分離純化。利用本發明方法得到的mRNA回收率高，純度高；避免使用價格昂貴的層析介質，成本相對較低；操作簡單并且能在室溫下進行操作，并且無需有毒試劑，易于放大到工業化規模生產。總之，本發明提供了一種簡便、成本低、易于放大的分離純化獲得高收率、高純度的mRNA的方法，具有很好的實際應用價值。

技術領域

本發明屬于本發明屬于核糖核酸分離純化技術領域，涉及一種mRNA的分離純化方法。

背景技術

核糖核酸(Ribonucleic acid，RNA)在生物學、醫學和納米技術等領域中有著廣泛的應用。其中，信使RNA(Messenger RNA，mRNA)在蛋白質的合成中主要作為編碼遺傳信息的載體而發揮作用，天然mRNA具有單鏈結構，由5`端結合的7-甲基鳥苷殘基(5`-cap)和3`端poly A尾組成。5`端的7-甲基鳥苷帽子結構以及3`端的poly A尾巴不僅對于mRNA的結構起著穩定作用而且對于mRNA在細胞質中的翻譯效率也有著很大的影響。

基于mRNA的療法近年來受到廣泛關注，因為mRNA只需要到達細胞的細胞質進行翻譯便可以產生目標蛋白，極大提高了治療效率，同時mRNA不會插入到宿主細胞的基因組中，極大程度地降低了插入所產生的突變風險，提高了mRNA治療的安全性。除此之外用于治療的mRNA只產生瞬時翻譯并通過生理途徑完全降解。目前，mRNA已被用于疫苗、腫瘤治療和基因編輯等領域的研究中。

獲得高純度的mRNA是保證mRNA相關療法的安全性和有效性的關鍵。目前，治療用的mRNA是在T7聚合酶的作用下，以線性化的質粒為模板通過體外轉錄合成。轉錄后的mRNA中主要存在轉錄相關的RNA聚合酶、DNA模板、核苷三磷酸(NTPs)底物、以及轉錄副產物(dsRNA，短轉錄物)等雜質組分；這些雜質不僅會對mRNA后續加帽過程的效率產生影響，更會影響到最終產品的安全性，例如雙鏈RNA的存在會引起I型干擾素上升，進而引起先天免疫激活反應。此外，與未純化轉錄本相比，經過純化之后，mRNA疫苗有蛋白表達率提高1000倍，因此需要對這些雜質進行去除。

RNA常用的純化的方法包括沉淀法、溶劑法、超速離心法、聚丙烯酰胺法、膜分離法和色譜純化法。其中，色譜法是目前工業生產中最常用的純化方法，純化mRNA常用的方法包括：凝膠過濾、陰離子交換層析、親和層析、反相離子對色譜層析、纖維素色譜層析、反相色譜層析、羥基磷灰石層析等方法；這些方法均有各自的優缺點，例如oligo(dT)親和層析盡管具有較高的特異性，與oligo dT的雜交親和性可用于捕獲，但它具有一些局限性，其載量低、成本高，它無法區分ssRNA和dsRNA，也無法根據大小對mRNA進行分級分離，完整的產品、不完整的轉錄體、寡聚體、片段、聚體，任何具有可結合poly-A尾巴的物質都會與所有其他物種一起洗脫；凝膠過濾層析無法去除分子量相近的異常mRNA，如ds RNA；陰離子交換無法分辨mRNA和DNA模板；而反相離子對色譜和反相色譜則需使用有機溶劑。因此，難以經過一步純化獲得較純的mRNA，需要多種方法進行組合，常采用親和粗純加精純組合進行純化。此外，上述部分方法需要采用高溫純化來提高分辨率和純化效率，這進一步增加了純化的復雜性和成本。

因此，提供一種簡單高效的純化方法對于mRNA的研究和應用具有重要意義。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種mRNA的分離純化方法。

為達到此發明目的，本發明采用以下技術方案：

第一方面，本發明提供一種mRNA的分離純化方法，所述mRNA的分離純化方法包括將待分離純化的mRNA原料經過兩次疏水層析進行分離純化。

優選地，所述待分離純化的mRNA原料由DNA轉錄得到，所述轉錄后還任選地包括加帽和/或加尾。