[發明專利]五味子松脂醇-落葉松脂醇還原酶及其編碼基因和應用

有效

• 申請號: 202210692604.1
• 申請日: 2022-06-17
• 公開（公告）號: CN115197921B
• 公開（公告）日: 2023-09-22
• 發明（設計）人: 肖瑩;馬雪祺;陳萬生;段永豪
• 申請（專利權）人: 上海中醫藥大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12P17/04;C12P7/22
• 代理公司: 上海唯智贏專利代理事務所(普通合伙) 31293
• 代理人: 吳瑾瑜

本發明涉及生物技術領域，具體為一種來源于五味子的松脂醇?落葉松脂醇還原酶PLR及其基因。本發明從五味子中克隆出并篩選了多種ScPLRs，并對其進行生物信息學分析，再通過異源表達以及體外酶活實驗，最終明確其結構特征及功能，發現其具有不同的催化活性，具有良好的應用前景，并為五味子中木脂素生物合成相關基因的研究提供基礎。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種來源于五味子的松脂醇-落葉松脂醇還原酶、編碼基因及其應用。

背景技術

五味子作為傳統中草藥，具有2000多年的使用歷史。它被收錄在中國、日本、韓國、俄羅斯、歐洲、美國藥典以及世界衛生組織編輯的國際藥典中。五味子中含有木脂素類、萜類、多糖、揮發油類、類黃酮、有機酸類等多種活性成分。

目前已從五味子中分離出100多種木脂素類化合物。其中，木脂素是由苯丙氨酸單體氧化聚合形成的一大類天然產物。五味子中的木脂素主要屬于二苯并環辛烷型，包括五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酚等。研究表明其具有抗氧化、抗癌、神經保護、保肝、抗炎等多種藥理作用。

松脂醇-落葉松脂醇還原酶(PLR)是木脂素類化合物生物合成的關鍵酶，是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)的還原酶。基于預測的五味子中木脂素生物合成途徑，PLR能夠催化兩個步驟：一是在合成羅漢松脂素的過程中先后催化松脂醇生成落葉松脂醇和開環異落葉松脂素，二是在合成五味子素的過程中催化Verrucosin生成二氫愈創木酸(Dihydroguaiaretic?acid)。

目前已經從多種植物中分離出PLR基因，例如連翹(Forsythia?intermedia)、擬南芥(Arabidopsis?thaliana)、亞麻(Linum?album或Linum?usitatissimum)、茶(Camelliasinensis)、菘藍(Isatis?indigotica)、北美喬柏(Thuja?plicata)、宿根亞麻(Linumperenne)等。擬南芥的AtPLRs對松脂醇表現出嚴格的底物偏好性，但對落葉松脂醇只有微弱的甚至沒有催化活性，所以將其命名為AtPRR1和AtPRR2。從亞麻Linum?album中發現的LaPLR1只能將(+)-松脂醇(pinoresinol，簡稱Pin)轉化成(-)-開環異落葉松脂素(secoisolariciresinol，簡稱Sec)，而LuPLR1是只能將(-)松脂醇轉化成(+)-開環異落葉松脂素。茶Camellia?sinensis中的CsPLRs(CsPLR1和CsPLR2)也有催化松脂醇轉化成開環異落葉松脂素的功能，只是CsPLR1可以將(+)-和(-)-松脂醇轉化為落葉松脂醇(lariciresinol，簡稱Lar)和開環異落葉松脂素，而CsPLR2只能選擇性地催化(+)-松脂醇轉化為(-)-開環異落葉松脂素，通過定點突變CsPLR1的L174I發現其喪失了催化松脂醇但保留了催化(-)-落葉松脂醇的能力。菘藍IiPLR1能夠催化松脂醇轉化為落葉松脂醇，再進一步轉化落葉松脂醇為開環異落葉松脂素，并且過表達IiPLR1的菘藍轉基因毛狀根中落葉松脂醇的積累顯著增加。對IiPLR1和AtPLRs的蛋白晶體結構的對比研究明確了決定PLR底物的選擇和結合以及催化功能的關鍵氨基酸殘基，并通過定點突變改變IiPLR1的蛋白結構，使其底物選擇性改變，從而在大腸桿菌中特異性積累落葉松脂醇。

以上研究結果都證實了PLR在木脂素生物合成過程中的重要作用，但目前還沒有對于五味子中相關PLR進行開發利用的報道，因此開發五味子中PLR對木脂素生物合成具有重要意義。

發明內容

本發明旨在提供五味子中松脂醇-落葉松脂醇還原酶(PLR)酶及基因。

本發明還提供了上述基因和酶的應用。

本發明的另一個目的在于提供落葉松脂醇和開環異落葉松脂素的制備方法。

技術方案如下，五味子松脂醇-落葉松脂醇還原酶，含有SEQ?ID?No.2–5之一所示的氨基酸序列。