[發明專利]一種基于DNAzyme變構調節的DNA四面體樣納米機器、miRNA檢測方法及應用

在審

• 申請號: 202210636366.2
• 申請日: 2022-06-07
• 公開（公告）號: CN114934099A
• 公開（公告）日: 2022-08-23
• 發明（設計）人: 陽莎;余戀雨;陳鳴;唱凱;詹新宇;羅潔;陳志國;王彬潘;趙爽;湯曉琦
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍陸軍軍醫大學第一附屬醫院
• 主分類號: C12Q1/6825
• 分類號: C12Q1/6825;C12N15/11
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 黃明光

本發明提供了一種基于DNAzyme變構調節的DNA四面體樣納米機器、miRNA檢測方法及應用，涉及miRNA檢測技術領域技術領域。本發明提供了一種基于DNAzyme變構調節的DNA四面體樣納米機器，所述納米機器由寡核苷酸鏈P1?P5和一條抑制劑鏈組成。本發明所述的DNA四面體樣納米機器使DNAzyme和底物在空間上更加接近，并在一定程度上包裹DNAzyme，可顯著增強DNAzyme的靈敏度、細胞滲透能力和抗酶降解能力。

技術領域

本發明涉及miRNA檢測技術領域，具體涉及一種基于DNAzyme 變構調節的DNA四面體樣納米機器、miRNA檢測方法及應用。

背景技術

MicroRNAs(miRNAs)通過在轉錄后水平調控mRNA，進而調控下游蛋白質的變化，在細胞增殖、發育和成熟等方面發揮關鍵作用， miRNAs也因此成為新治療方法的最有吸引力的工具和靶點之一。另一方面，miRNAs的異常表達與許多人類疾病如實體瘤、骨髓瘤和B 細胞淋巴瘤等密切相關。因此，miRNA也被認為是早期癌癥診斷和預后的重要腫瘤生物標志物。與無細胞miRNA相比，細胞內miRNA 在高濃度和穩定性方面表現出顯著的優勢，而且原位檢測細胞內的 miRNA可以避免不同RNA提取方法的效率限制。因此，建立一種高靈敏度和特異性的集成納米機器同時實現細胞內miRNA檢測和負反饋濃度調節，有利于提高腫瘤的早期診斷和治療效率。

DNA不僅是遺傳信息的載體，也是DNA納米結構的分子構建模塊。DNA可以自我折疊成復雜的三級結構，形成具有特定識別和催化能力的功能性核酸，如適配體、DNAzymes、i-基序以及G四聯體等。這些功能性核酸在生物分子檢測、成像和藥物傳遞方面已顯示出極大的潛力。其中，DNAzymes是一種具有催化功能的單鏈核酸，同時具有DNA和酶的雙重作用，與蛋白酶相比，結構更穩定，也更易于合成和編程。通過DNA鏈置換，可以在不改變DNAzyme序列的基礎上，實現DNAzyme的變構，調節其活性。為了實現對miRNA 的同時檢測和調控，可以引入一條miRNA抑制鏈來介導DNAzyme 的活性。簡而言之，DNAzyme的活性取決于其構象改變，而其構象受到miRNA抑制劑的調控。miRNA抑制劑和靶標的結合可以觸發從鎖定的DNAzyme結構到活化的DNAzyme的構象變化。后者能夠切割底物并釋放熒光用于細胞內miRNA傳感。與此同時，miRNA抑制劑能競爭性抑制miRNA與下游基因的相互作用，從而調節靶細胞的功能。因此，這種miRNA抑制劑控制的變構DNAzyme可用于miRNA 傳感和靶細胞的同步調節。然而，DNAzyme的細胞滲透性不足，需要選擇合適的遞送系統。

目前，轉運DNAzyme及其底物到細胞內主要依賴于轉染試劑和無機納米材料。然而這些添加的成分具有生物相容性風險，并會使 DNAzyme的制備更加復雜。DNA四面體作為DNA折紙技術的典型代表，因其具有結構穩定、生物相容性好、易于靈活編程等優點，廣泛應用于靶向給藥、光熱治療、體內成像等領域。例如，DNA四面體可作為納米載體用來遞送siRNA以沉默靶基因，或傳遞亞甲藍用于體內光動力治療。然而，如何利用DNA四面體轉運DNAzyme仍舊是一個亟待解決的問題。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種基于DNAzyme變構調節的DNA四面體樣納米機器，可用于微量miRNA的傳感及濃度調節，具有良好的靈敏度和特異性。

為解決上述技術問題，本發明提供了以下技術方案：

本發明提供了一種基于DNAzyme變構調節的DNA四面體樣納米機器，所述納米機器由寡核苷酸鏈P1-P5和一條抑制劑鏈組成，所述寡核苷酸鏈P5與抑制劑鏈互補，所述抑制劑鏈含有DNA識別序列，所述DNA識別序列能夠與待測miRNA結合。

優選的，所述寡核苷酸鏈P1、P2、P4、P3部分序列、P5部分序列構成所述DNA四面體的主框架；所述P5鏈的中間部分為E6型 DNAzyme。