[發明專利]一種用于抑制心肌肥大的生物源納米硒的制備方法及藥物

在審

• 申請號: 202210620708.1
• 申請日: 2022-06-02
• 公開（公告）號: CN114921500A
• 公開（公告）日: 2022-08-19
• 發明（設計）人: 周東海;符楊;楊小琦;張嘉賓;高蓉;王飛帆;張夢迪
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12P3/00
• 分類號: C12P3/00;C12N1/20;A61K33/04;A61P9/00;G01N21/31;C12R1/085;C12R1/125
• 代理公司: 重慶信必達知識產權代理有限公司 50286
• 代理人: 陳小東

1.一種用于抑制心肌肥大的生物源納米硒的制備方法及藥物，其特征在于，所述用于抑制心肌肥大的生物源納米硒的菌株篩選及制備方法包括：從已有菌株中選出亞硒酸鈉還原率最佳的一株，并篩選出其最佳培養濃度和時間，采用該篩選菌株和篩選條件利用微生物還原法進行納米硒的制備。

2.如權利要求1所述用于抑制心肌肥大的生物源納米硒的菌株篩選方法，其特征在于，所述用于抑制心肌肥大的生物源納米硒的菌株篩選方法包括以下步驟：

步驟一，選擇6株來自牦牛源、馬源的益生菌，并對選擇的6株益生菌進行純化；將純化后的益生菌按1％的接種量接種至含有3、6、12、18、24、30mmol/L硒元素的LB肉湯中常規培養；

步驟二，根據細菌發酵液的顏色，試管底部的紅色沉淀多少，以及DAB法測量得到的亞硒酸鈉還原率篩選出最佳菌株；

步驟三，將篩選的菌株在含3、6、12、18、24、30mmol/L亞硒酸鈉的LB瓊脂平板上劃線培養，挑取紅色單菌落，重復3次液體發酵、瓊脂平板劃線，驗證菌株；

步驟四，將選出的菌株按1％的比例接種至含有18、20、22.5、24mmol/L亞硒酸鈉的LB肉湯中進行濃度篩選。選出最適濃度后，將菌株按1％的比例接種至含有最適濃度亞硒酸鈉的LB肉湯中培養12、24、48、72、96、120h進行時間篩選。

3.如權利要求1所述用于抑制心肌肥大的生物源納米硒的制備方法，其特征在于，所述用于抑制心肌肥大的生物源納米硒的制備方法包括以下步驟：

步驟一，將篩選出的菌株在LB肉湯中搖床培養至OD600為0.7時按1％的比例接種至含亞硒酸鈉最佳濃度的LB肉湯中，在37℃，180r/min的條件下培養最適時間；

步驟二，將培養好的菌液在4℃，13000r/min離心10min，棄去上清；將沉淀用0.9％NaCl清洗三次，每次在12000r/min離心8min；清洗后將沉淀置于無菌研缽中，加入液氮研磨；研磨后用少量無菌水重懸，然后在冰浴、功率為100W的條件下超聲處理10min，在4℃、12000r/min離心10min并收集沉淀物；用含1％SDS的1.5mol/L Tris-HCl(pH 8.3)離心洗滌沉淀物3次，最后用無菌水洗滌3次；

步驟三，用無菌水重懸沉淀物，按V重懸液∶V正辛醇＝2：1的比例加入正辛醇。充分混勻后，4℃，2000g離心5min，分離混合相，并在4℃下儲存24h；

步驟四，經過24h后，將液體棄去，留沉淀；然后重復步驟三，直至混合相中間沒有細菌碎片；然后棄去液體，沉淀用無菌水換管清洗5次，無菌水重懸，靜置10分鐘后吸取液體；

步驟五，納米硒顆粒的制備：將在4℃靜置24小時后的上下相棄去，留沉淀；然后分別用氯仿、75％乙醇清洗一次；然后用無菌水重懸沉淀，進行冷凍干燥48h以上，得到納米硒顆粒；

步驟六，對納米硒進行表征和Na₂S法檢測純度。

4.如權利要求2所述用于抑制心肌肥大的生物源納米硒的菌株篩選方法，其特征在于，所述4株來自牦牛源、2株來自馬源的益生菌包括：蠟樣芽孢桿菌A1、蠟樣芽孢桿菌A2、蠟樣芽孢桿菌A3、枯草芽孢桿菌E1、枯草芽孢桿菌4.3、枯草芽孢桿菌9.3。

5.如權利要求2所述用于抑制心肌肥大的生物源納米硒的菌株篩選方法，其特征在于，步驟一中，所述純化包括：將已有的6株菌在LB肉湯培養基中常規培養，然后在LB瓊脂平板上劃線培養，挑取單菌落，重復液體發酵、瓊脂平板劃線，3次后提取細菌DNA進行測序鑒定。

6.如權利要求2所述用于抑制心肌肥大的生物源納米硒的菌株篩選方法，其特征在于，步驟一中，所述搖床培養包括：37℃、180r/min的搖床中培養120h。