[發明專利]一種利用重組谷氨酸棒桿菌代謝甘露醇發酵提高L-鳥氨酸產量的方法

在審

• 申請號: 202210544033.7
• 申請日: 2022-05-18
• 公開（公告）號: CN115896153A
• 公開（公告）日: 2023-04-04
• 發明（設計）人: 張斌;聶立斌;盛琦;許可心
• 申請（專利權）人: 江西農業大學
• 主分類號: C12N15/77
• 分類號: C12N15/77;C12N15/67;C12N15/64;C12N15/61;C12N15/31;C12N15/53;C12P13/10;C12R1/15
• 代理公司: 江西省專利事務所 36100
• 代理人: 殷勇剛

1.一種利用重組谷氨酸棒桿菌代謝甘露醇發酵提高L-鳥氨酸產量的方法，包括如下步驟：

(1)篩選遺傳改造靶點基因：

分別用葡萄糖和甘露醇為唯一碳源，對谷氨酸棒桿菌MTL01進行培養，收集對數期樣本進行轉錄組分析，獲得基因表達差異詳情表進行深度挖掘，設定p＜0.05閾值，挑選顯著上下調基因，同時結合差異表達基因相關代謝途徑分析得到3個可能對L-鳥氨酸產量有增益的靶點基因，包括2個顯著上調基因qsuR和CGS9114_RS08985以及1個下調基因pdxR；

(2)構建重組質粒pK18-P_sod-qsuR、pK18-P_sod-CGS9114_RS08985和pK18-T-pdxR：

以谷氨酸棒桿菌S9114基因組為模板進行PCR，將強啟動子P_sod分別插入2個顯著上調基因qsuR和CGS9114_RS08985上游的非編碼區，分別構建含有融合片段P_sod-qsuR基因和P_sod-CGS9114_RS08985基因的重組質粒pK18-P_sod-qsuR和pK18-P_sod-CGS9114_RS08985；

以谷氨酸棒桿菌S9114基因組為模板，通過PCR獲得pdxR基因編碼區插入T終止子的基因片段T-pdxR，將其一步克隆至谷氨酸棒桿菌自殺性質粒pK18mobsacB，構建含有T-pdxR基因的重組質粒pK18-T-pdxR；

(3)構建重組谷氨酸棒桿菌MTL14、MTL16和MTL19：

在谷氨酸棒桿菌MTL13基礎之上，分別導入重組質粒pK18-P_sod-qsuR、pK18-P_sod-CGS9114_RS08985和pK18-T-pdxR，強化qsuR基因和CGS9114_RS08985基因的表達以及阻斷基因pdxR的表達，得到重組谷氨酸棒桿菌MTL14、MTL16和MTL19；

(4)構建重組谷氨酸棒桿菌MTL21和MTL24：

將重組質粒pK18-P_sod-CGS9114_RS08985和pK18-T-pdxR分別導入重組谷氨酸棒桿菌MTL14，獲得重組谷氨酸棒桿菌MTL21和MTL24；

(5)構建重組谷氨酸棒桿菌MTL25：

將重組質粒pK18-P_sod-CGS9114_RS08985導入重組谷氨酸棒桿菌MTL24，獲得重組谷氨酸棒桿菌MTL25；

(6)好氧發酵合成L-鳥氨酸：

將步驟(3)-(6)中獲得的重組谷氨酸棒桿菌MTL14、MTL16、MTL19、MTL21、MTL24和MTL25分別接種于鳥氨酸發酵培養基進行好氧發酵，6株重組谷氨酸棒桿菌分別按5-20v/v％接種量接種于鳥氨酸發酵培養基，控制搖床轉速為250rpm，溫度為32℃，發酵時間為48-72h，pH為6.8；

所述鳥氨酸發酵培養基包括甘露醇、酵母粉、(NH₄)₂SO₄、MgSO₄、KH₂PO₄、K₂HPO₄、Na₂HPO₄、FeSO₄、MnSO₄和CaCO₃；

發酵結束后收集發酵液，測定其發酵液上清中的鳥氨酸和甘露醇含量。

2.如權利要求1所述利用重組谷氨酸棒桿菌代謝甘露醇發酵提高L-鳥氨酸產量的方法，其特征在于，步驟(6)中所述鳥氨酸發酵培養基中各組分的含量(g/L)為：甘露醇：0～100、酵母粉：6～20、(NH₄)₂SO₄：30～60、MgSO₄：2～5、KH₂PO₄：0.5～1.5、K₂HPO₄：0.5～1、Na₂HPO₄：0.5～1、FeSO₄：0.01～0.03、MnSO₄：0.01～0.03和CaCO₃：5～15。