[發明專利]一種一日齡種鴨常見垂傳播病原的病料采集及檢測方法

在審

• 申請號: 202210532107.5
• 申請日: 2022-05-09
• 公開（公告）號: CN114891857A
• 公開（公告）日: 2022-08-12
• 發明（設計）人: 張中波;王勝;褚新星;汪建華;許明清
• 申請（專利權）人: 山東和康源生物育種股份有限公司;寧陽正和生物育種有限公司;山東寧陽和櫻種鴨有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/70;C12Q1/686;C12Q1/04;C12Q1/10;C12N15/11;A61B5/15;A61B5/153;A61B10/00;C12R1/42;C12R1/01;C12R1/93
• 代理公司: 北京科家知識產權代理事務所(普通合伙) 11427
• 代理人: 周瑜

1.一種一日齡種鴨常見垂傳播病原的病料采集及檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、雛鴨的頸上部緊靠頭的位置采集血氧待用，解剖一日齡種鴨，獲取內臟和組織，泄殖腔棉拭子采樣；

S2、首先利用內臟和組織對沙門氏菌、鴨疫里默氏桿菌進行分離鑒定，同時檢測垂直傳播病毒；

S3、待檢雛鴨用消毒液將羽毛打濕，置于剖檢臺，點燃酒精燈，打開腹腔，灼燒吊菌環，無菌采集肝臟、腦組織，5％血清瓊脂培養基劃線分離；

S4、采集的組織樣品進行研磨處理后，對禽流感病毒、呼腸孤病毒、鴨坦布蘇病毒、新型鴨細小病毒、鴨肝炎病毒的進行檢測，取離心后的上清液提取病毒RNA或DNA，RNA反轉錄為cDNA后進行PCR擴增，DNA進行PCR擴增可以得到相應病毒的目的片段，隨后測序，確定是否感染病毒。

2.據權利要求1所述的一種一日齡種鴨常見垂傳播病原的病料采集及檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：根據S1中的操作步驟，所述采好的血樣要豎立放置，避免受冷和振動，在25-37℃環境中靜置10-30min，這樣有利于血液凝固和析出血清，否則容易發生溶血，然后放置4℃冰箱不少于4小時，待纖維蛋白收縮后，將血液以3000r/min離心10分鐘，取血清作為待檢樣品。

3.據權利要求1所述的一種一日齡種鴨常見垂傳播病原的病料采集及檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：根據S1中的操作步驟，所述雛鴨體表進行消毒，從腹部剪開羽毛皮膚，打開腹腔漏出內臟，采集臟器主要有肝臟、脾臟、腎臟、肺臟、胰腺、腦等組織臟器，未吸收完全的卵黃單獨摘除，防止破裂撒體腔內，在樣品采集選擇上，最好多選取幾只病料進行集中混合，防止個體選擇上造成漏檢，同時根據重點疫病特點，選取針對性病毒含量高的部位進行采集，所采集的組織臟器不宜過大，一般采集2×2cm大小的組織即可，較小的臟器可以全部取出。

4.據權利要求1所述的一種一日齡種鴨常見垂傳播病原的病料采集及檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：根據S1中的操作步驟，所述通過泄殖腔拭子采樣的步驟包括：將無菌拭子用無菌生理鹽水濕潤后，插入雛鴨泄殖腔內，轉動3-5圈，投入無菌離心管中，折斷拭桿，使其完全置于管中，蓋緊管蓋。

5.據權利要求1所述的一種一日齡種鴨常見垂傳播病原的病料采集及檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：根據S2中的操作步驟，所述肝臟、卵黃取樣，無菌鑷子取少量肝臟進入增菌液，取上述增菌液分區劃線接種于ss培養基上，進行菌落培養，SS培養基出現紫色菌落，即可判定含有沙門氏菌。

6.據權利要求1所述的一種一日齡種鴨常見垂傳播病原的病料采集及檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：根據S3中的操作步驟，所述無菌采集肝臟、腦組織，5％血清瓊脂培養基劃線分離，5％血清營養培養基平板上生長出均勻一致的菌落，表面光滑，呈水滴狀，稍隆起，圓形，邊緣整齊，45度角對光觀察可見淡藍色熒光，血清型鑒定：將純化后的鴨疫里默氏桿菌用無菌PBS吹下，吹下來的菌落呈乳白色，分別取25μL菌液與1、2、6、7、10型等陽性血清混合，對應血清型在玻片上出現顆粒狀凝集。

7.據權利要求1所述的一種一日齡種鴨常見垂傳播病原的病料采集及檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：根據S4中的操作步驟，所述鴨呼腸孤病毒的檢測方法包括：采集的組織樣品進行研磨處理后，取離心后的上清液提取病毒RNA，并反轉錄為cDNA后進行PCR擴增，擴增引物為：

XREO-P1:ACCTCAGGATATCGCTGAAACT；

XREO-P2:CTCCATCCCTGCAGCACATGTAAAG；

目的片段為580bp，擴增程序為50℃30min，94℃5min，95℃30s，54℃30s，72℃80s，72℃8min；

結果判定：鴨呼腸孤病毒RT-PCR擴增可以得到相對應目的條帶大小的片段，則判定相應的病料為陽性。