[發明專利]利用煙酰胺發酵生產NMN的基因工程菌的構建與應用

在審

• 申請號: 202210529023.6
• 申請日: 2022-05-16
• 公開（公告）號: CN114836495A
• 公開（公告）日: 2022-08-02
• 發明（設計）人: 李冰;石磊;蔡孟浩;任燕娜
• 申請（專利權）人: 藍色光鑰(上海)智能科技有限公司
• 主分類號: C12P19/30
• 分類號: C12P19/30;C12N1/19;C12N15/81;C12N15/54;C12N15/31;C12R1/84
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

本發明提供了一種利用煙酰胺發酵生產NMN的基因工程菌的構建與應用。通過基因重組技術在酵母工程菌中引入了外源的Nampt基因，獲得可生產NMN的酵母工程菌。并通過異源表達NiaP和PnuC蛋白提升了底物攝取和NMN產物外排。所述酵母工程菌具有代謝背景低、異源表達能力強，可利用煙酰胺發酵生產NMN等特征，為工業化生產NMN提供了新思路。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，更具體地，本發明涉及生產煙酰胺單核苷酸(NMN)的基因工程菌的構建與應用。

背景技術

煙酰胺單核苷酸(NMN)是人體內自然存在的物質，在細胞內可轉化為與人體新陳代謝相關的重要輔酶NAD⁺。研究證實細胞內NAD⁺含量會隨著年齡的增加而減少，外源性補充NMN被認為具有強化人體細胞功能的作用。

目前NMN原料的生產方法主要有如下三種：

一是化學合成法。該法工藝簡單、成本低，主要是通過化合物之間的反應來完成，需要用到多種有機溶劑作為媒介。對于化學合成工藝獲得較純的化合物在中國申請新食品原料原則上一般不予批準，因此不推薦使用化學合成法生產的NMN原料。

二是生物酶催化法。該工藝不借助微生物，而是通過特定的工程酶，以酶催化合成的方式來進行生產。此法產出的NMN原料純度高、生產方式相對溫和，整個過程緩慢、持久。生物酶催化法是目前比較通行的生產方式，但是門檻較高，幾個關鍵催化酶價格不菲，約占整個生產過程成本的80％。

三是發酵法。借助微生物進行全細胞發酵生產。該法生成過程溫和、綠色環保，不會引入重金屬離子等，但目前生產效率低下、發酵過程復雜，原料成本較高，使高效率的工業規模化生產受限。在一些表達體系中，由于表達效率的限制，表達酶之后還需要進行細胞收集濃縮、之后再添加底物進行催化合成(發酵和酶催化相結合的生產方法)，導致生產過程復雜、易受污染。

盡管畢赤酵母已經被應用于一些目標產物的生產發酵，但鑒于不同工程細胞的胞內機理機制的不同，對于NMN這一產物而言，其生產需要胞內多種蛋白/酶的作用，畢赤酵母的胞內體系中是否存在兼容/配合其成功生產的途徑尚未知曉，在本領域中還沒有成功實現NMN的畢赤酵母細胞生產。

綜上，本領域還需要豐富NMN的生產方法，優化NMN的生產工藝，以期提高生產效率以及降低生產成本。

發明內容

本發明的目的在于提供利用煙酰胺作為底物發酵生產NMN的基因工程菌的構建與應用。

在本發明的第一方面，提供一種生產煙酰胺單核苷酸(NMN)的方法，所述方法包括：(1)提供酵母工程菌，所述酵母工程菌中轉化有下組基因的表達盒：NiaP，PnuC以及Nampt；所述Nampt選自Nampt3、Nampt2或Nampt1；(2)培養(1)的酵母工程菌，添加煙酰胺(Nam)作為底物生成煙酰胺單核苷酸產物，收獲產物。

在一種或多種實施方式中，所述酵母工程菌中，所述Nampt優選Nampt3，從而提高煙酰胺單核苷酸(NMN)的產量。

在一種或多種實施方式中，步驟(2)中，培養(1)的酵母工程菌后，直接添加煙酰胺作為底物生成煙酰胺單核苷酸產物。

在一種或多種實施方式中，培養(1)的酵母工程菌后，不包括進行細胞收集和/或濃縮的步驟，直接添加底物和進行產物的生產。

在一種或多種實施方式中，所述的表達盒中還包括啟動子，所述的啟動子包括(但不限于)：組成型啟動子或甲醇誘導型啟動子；較佳地，所述的組成型啟動子包括(但不限于)GAP啟動子；較佳地，所述的甲醇誘導型啟動子包括(但不限于)：AOX1啟動。

在一種或多種實施方式中，所述的培養酵母工程菌所用的培養基包括(但不限于)：YPD、YPG、YPM培養基。