[發明專利]一種非洲豬瘟病毒優勢抗原的篩選、制備及應用

在審

• 申請號: 202210481005.5
• 申請日: 2022-05-05
• 公開（公告）號: CN115160411A
• 公開（公告）日: 2022-10-11
• 發明（設計）人: 鄭浩;許朝陽;桑國菊;童光志;單同領;胡一帆;張曉旺
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院上海獸醫研究所
• 主分類號: C07K14/03
• 分類號: C07K14/03;C07K1/22;C12N15/38;C12N15/70;G01N33/569;A61K39/245;A61P31/22
• 代理公司: 北京市誠輝律師事務所 11430
• 代理人: 范盈

1.一種非洲豬瘟病毒優勢抗原，其特征在于所述非洲豬瘟病毒優勢抗原為重組p30蛋白、p54、KP177R中的一個或多個，所述優化重組p30蛋白、p54、KP177R的核苷酸編碼序列分別如SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.35所示。

2.如權利要求1中所述的一種非洲豬瘟病毒優勢抗原，是其病毒基因的全部或部分序列克隆于原核表達載體pColdI，經低溫(16℃)誘導表達，其中p54蛋白呈可溶性表達，經His柱純化制備，而p30和KP177R蛋白呈包涵體表達，經包涵體變性、His柱純化以及透析復性而制備，具備良好的生物活性，與ASFV陽性豬血清呈高水平反應，是一種優異的ASFV抗原。

3.如權利要求2中所述的一種非洲豬瘟病毒優勢抗原，其中p30和KP177R蛋白的純化制備中經復性緩沖液(50mM Tris-HCl,100mM NaCl,1％甘氨酸，5％甘油，0.2％PEG 3350，1mM氧化型谷胱甘肽，1mM還原型谷胱甘肽)透析復性，其具備良好的生物活性，與ASFV陽性豬血清呈高水平反應，特別是制備的p30蛋白，與不同ASFV陽性豬血清均呈高水平ELISA反應，是一種優異的ELISA診斷抗原。

4.一種ASFV抗體ELISA檢測方法，其以權利要求1中所述的p30蛋白、p54、KP177R中的一個或多個為包被抗原，制備及檢測參數為：每孔p30蛋白包被量為20ng；0.05M碳酸鹽緩沖液為包被液、37℃包被1h；5％脫脂乳為封閉液、37℃封閉時間1h；檢測血清作1:40倍稀釋，37℃孵育1h；酶標二抗稀釋度為1:1×10⁴,37℃孵育1h；TMD室溫下顯色10min。

5.一種非洲豬瘟病毒抗原，其特征在于所述非洲豬瘟病毒抗原為優化重組E199L,E184L,B475，E120R、A104R、A137R、K145R、CP312R、p12-p17-p10和I73R-B169L中的一個或多個，其中重組蛋白p12-p17-p10為ASFV p12、p17、p10三種蛋白胞外區的融合表達物，I73R-B169L為I73R和B169L二種蛋白胞外區的融合表達物，所述優化重組E199L,E184L,B475，E120R、A104R、A137R、K145R、CP312R、p12-p17-p10和I73R-B169L的編碼核苷酸序列分別如SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.9所示。

6.如權利要求5所述的一種非洲豬瘟病毒抗原，其中抗原E199L,E184L,B475，E120R、A104R、A137R、K145R、CP312R、p12-p17-p10和I73R-B169L蛋白，是其病毒基因的全部或部分序列經密碼子優化后克隆于原核表達載體pColdI，經16℃誘導表達及純化而制備。

7.權利要求1中的p30蛋白、p54蛋白、KP177R蛋白和權利要求5中的E199L蛋白,E184L蛋白,B475蛋白，E120R蛋白、A104R蛋白、A137R蛋白、K145R蛋白、CP312R蛋白、p12-p17-p10蛋白和I73R-B169L蛋白中的一個或多個在ASFV亞單位疫苗制備中的應用，上述蛋白能與ASFV陽性豬血清發生不同程度的抗原抗體反應，顯示具有刺激宿主產生抗體的功能。