[發明專利]一種膜蛋白工程化外泌體及其制備方法

在審

• 申請號: 202210469355.X
• 申請日: 2022-04-30
• 公開（公告）號: CN114807046A
• 公開（公告）日: 2022-07-29
• 發明（設計）人: 孫振;崔恒宓
• 申請（專利權）人: 江蘇易諾維生物醫學研究院有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/62;C12N15/867;C12N15/66
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本發明公開了一種膜蛋白工程化外泌體及其制備方法，所述外泌體膜蛋白慢病毒表達載體能將外源基因高效的表達到外泌體的膜上，所述方法為：將所需表達至外泌體膜上的基因與外泌體膜蛋白LAMP2B的信號肽(SP)和跨膜區(TMD)序列融合，組成LAMP2B_SP?轉基因序列?LAMP2B_TMD融合序列，隨后將所述序列克隆至慢病毒表達載體，感染細胞系，分離純化得到膜蛋白工程化外泌體。經實驗驗證，本方法成功將可溶性蛋白VEGF和細胞膜蛋白CD24高效表達至外泌體膜上，本方案優化了基因工程化外泌體的改造方法，提高了外泌體表面的修飾效率，對于外泌體作為藥物載體的靶向性研究和應用具有重要的意義。

技術領域

本發明屬于生物醫學技術領域，特別是涉及一種膜蛋白工程化外泌體及其制備方法。

背景技術

細胞外囊泡(EVs)是由細胞衍生的微小的、納米尺度的囊泡，存在于生物體液中，包括血液、唾液、母乳、唾液和腦脊液，起到細胞間通訊的作用。根據生物起源、特性和尺寸，EVs主要分為：外泌體(EVssomes)直徑為30-150nm，起源于內吞途徑；微囊泡(microvesicles)直接從質膜釋放，直徑約100-1000nm；凋亡小體(apoptoticbody)直徑約為50nm-2μm，由細胞凋亡產生。其中，由于外泌體具有天然來源、高生物相容性和納米尺寸等優點，它在藥物傳遞和腫瘤治療方面表現出極大的潛力。當外泌體在1980年首次被發現后，其被認為是細胞排泄廢物的一種方式，如今隨著大量對其生物來源、其物質構成及運輸、細胞間信號的傳導以及在體液中的分布的研究發現外泌體具有多種多樣的功能。

近年來研究發現，外泌體在作為藥物體內運輸載體上展現出極大的優勢。外泌體相比于現有的人工合成材料，在遞呈藥物上具有多種優點。雖然研究表明，由于外泌體膜表面受體和細胞外基質結合蛋白等作用，不同來源的外泌體，在體內顯示不同的歸巢能力。在腫瘤治療過程中，如何通過外泌體將包封藥物準確遞送至腫瘤部位，從而提高藥物利用率、降低副作用仍是亟需解決的問題之一。

基于外泌體的分子運輸能力以及靶向特性，研究人員開發出了基于工程化外泌體的特定細胞靶向遞送工具。外泌體的表面修飾策略包括化學修飾和基因工程。化學修飾通過綴合反應或脂質組裝展示各種天然和合成配體，但外泌體表面的復雜性可能會降低反應效率，甚至危及載體的結構和功能。基因工程將引導蛋白或多肽的基因序列與選定的外泌體膜蛋白的基因序列融合，能夠有效地在外泌體表面展示特異引導性肽和蛋白質。目前常用于融合的外泌體膜蛋白包括CD9、CD63和LAMP2B等。CD9和CD63為四次跨膜蛋白，N端和C端均在胞內區，僅適用于胞外區改造，展示一些短的靶向肽。對于LAMP2B等單次跨膜蛋白，常用的方法是將靶向肽或目的基因序列與LAMP2B完整蛋白序列融合，對于一些短肽此方法較為適用，但若是融合一些較長的蛋白序列，則會導致質粒過大，降低轉染效率，不利于通過基因工程質粒轉染進行大規模穩轉細胞系制備。因此，開發一種高效的外泌體表面修飾方法，對于外泌體作為特定細胞靶向遞送工具的研究具有非常重要的意義。

發明內容

本發明主要解決的技術問題是提供一種膜蛋白工程化外泌體及其制備方法，構建具有外泌體膜定向表達功能序列的慢病毒載體，克隆目的蛋白序列并插入至上述載體中，形成外泌體膜蛋白慢病毒表達載體，穩轉細胞后，分離獲得膜蛋白工程化外泌體。

為解決上述技術問題，本發明采用的一個技術方案是：一種膜蛋白工程化外泌體及其制備方法，所述膜蛋白工程化外泌體是由外泌體膜蛋白慢病毒表達載體穩轉細胞后，分離獲得的；

所述外泌體膜蛋白慢病毒表達載體是由具有外泌體膜定向表達功能序列的慢病毒載體以及目的蛋白構建而成；

所述外泌體膜蛋白慢病毒表達載體的骨架載體為plvx-IRES-Puro；

所述外泌體膜蛋白慢病毒表達載體的功能序列結構，其從N端起，依次是外泌體膜蛋白的信號肽序列、外源基因插入區、鉸鏈區、外泌體膜蛋白的跨膜區序列和胞內序列。