[發明專利]使用分子量截留過濾和過濾器上去糖基化從復雜基質快速制備標記的葡基胺的方法

在審

• 申請號: 202210450206.9
• 申請日: 2017-06-19
• 公開（公告）號: CN114839302A
• 公開（公告）日: 2022-08-02
• 發明（設計）人: M.A.勞伯
• 申請（專利權）人: 沃特世科技公司
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06;C12P19/28;C07K1/13;C07K1/36;G01N33/68
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 初明明

本發明提供了用于從復雜基質制備標記的葡基胺的方法。所述方法包括以下步驟：使復雜基質中的糖蛋白變性而形成變性的復雜基質混合物；將所述變性的復雜基質混合物加載到MWCO過濾裝置上；將糖苷酶酶溶液添加到所述MWCO過濾裝置上而形成包含葡基胺的去糖基化的復雜基質混合物；收集從所述MWCO過濾裝置釋放的葡基胺；以及用快速標記試劑使葡基胺衍生化而形成適用于在各種液相色譜系統和檢測器中檢測的多種標記的葡基胺。

相關申請的交叉引用

本申請要求2016年7月1日提交的美國臨時專利申請No.62/357,552的優先權，該申請以引用方式并入本文。

背景技術

用于分析復雜基質中存在的糖蛋白的方法包括以下步驟：去糖基化，之后用標記試劑衍生化而產生衍生化的葡基胺。在某些條件下，可在不從生物樣品分離糖蛋白的情況下進行衍生化。在給定情況下，復雜基質中衍生化的葡基胺的分析可一直持續到包括高效液相色譜(“HPLC”)、超高效液相色譜(UHPLC)、質譜(“MS”)、超臨界流體色譜、紫外(“UV”)、熒光(“FLR”)檢測、基質輔助激光解吸/電離質譜(“MALDI-MS”)和/或毛細管電泳(“CE”)的分析和/或檢測。

此外，最近已開發了允許葡基胺的快速衍生化而不會引起生物樣品的降解或過度標記的方法。已描述了一種此類程序，其中樣品在不預先純化的情況下被去糖基化，并且用快速標記試劑RapiFluor-MS(“RFMS”)進行標記。參見作為WO 2016/069764公布的國際申請No.PCT/US2015/057848。然而，并非所有樣品類型都適于該簡約方法，因為它們可能含有能夠干擾葡基胺衍生化反應的親核分子。

在此類情況下，糖蛋白通常需要使用洗滌劑和其他試劑來有效增溶。必須在質譜檢測之前去除這些洗滌劑和試劑，因為它們的存在可不利于該分析。此外，可能需要大量細胞，這阻止了中至高通量分析并且通常排除了重復樣的制備，從而無法報告固有樣品間變異性之間的差別以及不同生物樣品之間的差異。Rahman,S.A,et al.,Filter-Aided N-Glycan Separation(FANGS):A Convenient Sample Preparation Methodfor MassSpectrometric N-Glycan Profiling,J.Proteome Res.2014,13,1167-1176(2014)at1167-68(Rahman,S.A等人，“過濾器輔助N-聚糖分離(FANGS)：一種用于質譜N-聚糖譜分析的方便樣品制備方法”，《蛋白質組研究雜志》，2014年，第13卷，第1167-1176頁中的第1167-1168頁)。

因此，已開發了克服這些問題的方法，這些方法可包括使用甲基酯化的唾液酸、昂貴試劑(諸如siRNA)和/或分離的膜–這些都不是適合中至高通量分析的溶液。同上第68頁。此外，這些方法的葡基胺分離和純化步驟可較復雜，特別是對于質譜分析而言。同上此外，已設計了將糖蛋白固定到膜上的方法。然而，這些膜由疏水性聚合物(諸如PVDF、尼龍和硝化纖維)構造而成，并且在結合能力方面有限，因為此類膜依賴于基于吸附的保留。參見例如Baginski等人的US 8,198,063 B1。例如，在越來越高的質量負載下，疏水性膜將變飽和。另外，非分析物疏水性化合物將污濁疏水性膜，達到超過糖蛋白對膜的吸附的程度。

因此需要可建立對復雜基質中的葡基胺的中至高通量分析的方法。

發明內容