[發明專利]使用分子量截留過濾和過濾器上去糖基化從復雜基質快速制備標記的葡基胺的方法

在審

• 申請號: 202210450206.9
• 申請日: 2017-06-19
• 公開（公告）號: CN114839302A
• 公開（公告）日: 2022-08-02
• 發明（設計）人: M.A.勞伯
• 申請（專利權）人: 沃特世科技公司
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06;C12P19/28;C07K1/13;C07K1/36;G01N33/68
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 初明明

1.一種用于從復雜基質制備標記的葡基胺的方法，包括以下步驟：

通過使所述復雜基質與包含緩沖液和表面活性劑的變性溶液混合并加熱，使所述復雜基質中的糖蛋白變性，以形成變性的復雜基質混合物；

將所述變性的復雜基質混合物稀釋并加載到MWCO過濾裝置上，并過濾所述變性的復雜基質混合物；

隨后將包含糖苷酶和非親核緩沖化合物的糖苷酶酶溶液添加到含有稀釋的變性的復雜基質混合物的MWCO過濾裝置上并溫育所述MWCO過濾裝置，其中所述MWCO過濾裝置上的所述糖蛋白被去糖基化，并且形成包含葡基胺的去糖基化的復雜基質混合物；

收集從所述MWCO過濾裝置釋放的葡基胺；以及

用快速標記試劑使葡基胺衍生化而形成多種標記的葡基胺，其中所述快速標記試劑的摩爾濃度是葡基胺的摩爾濃度的約50-約300倍。

2.根據權利要求1所述的方法，其中所述MWCO過濾裝置被加熱。

3.根據權利要求1所述的方法，其中所述變性的復雜基質混合物通過液體處理系統加載到所述MWCO過濾裝置上。

4.根據權利要求1所述的方法，還包括離心所述變性的復雜基質混合物的步驟。

5.根據權利要求1所述的方法，還包括稀釋所述去糖基化的復雜基質混合物的步驟。

6.根據權利要求1所述的方法，其中所述葡基胺穿過所述MWCO過濾裝置流動到濾液收集裝置。

7.根據權利要求1所述的方法，其中在液相色譜系統中檢測所述多種標記的葡基胺。

8.根據權利要求1所述的方法，其中所述MWCO過濾裝置是96孔濾板。

9.一種用于從復雜基質制備標記的葡基胺的試劑盒，包括MWCO過濾裝置、快速標記試劑、包含緩沖液和表面活性劑的變性溶液和包含糖苷酶和非親核緩沖化合物的酶溶液，其中所述變性溶液使所述復雜基質中的糖蛋白變性而形成變性的復雜基質混合物，所述MWCO過濾裝置被構造為過濾所述變性的復雜混合物，并且將所述酶溶液與所述過濾裝置上所述變性的復雜基質混合物一起混合和溫育而得到葡基胺，所述快速標記試劑使所述葡基胺衍生化，能夠在液相色譜、毛細管電泳或質譜系統中檢測所述葡基胺。

10.一種液相色譜系統，其包括MWCO過濾裝置、包含緩沖液和表面活性劑的變性溶液、包含糖苷酶和非親核緩沖化合物的酶溶液、熒光檢測裝置和質譜檢測裝置，其中所述MWCO過濾裝置、所述變性溶液和所述酶溶液被構造為產生葡基胺，所述葡基胺流過所述過濾裝置并且被收集用于由快速標記試劑衍生化以及后續在所述熒光檢測裝置中的熒光檢測和/或在所述質譜檢測裝置中的質譜檢測。

11.一種液體處理系統，其包括MWCO過濾裝置、包含緩沖液和表面活性劑的變性溶液以及包含糖苷酶和非親核緩沖化合物的酶溶液，其中所述MWCO過濾裝置、所述變性溶液和所述酶溶液被構造為產生葡基胺，所述葡基胺流過所述過濾裝置并且被收集用于由快速標記試劑衍生化以及后續在熒光檢測裝置中的熒光檢測和/或在質譜檢測裝置中的質譜檢測。

12.根據權利要求1所述的方法，其中所述復雜混合物選自血漿、細胞裂解物、生物流體和/或組織提取物。

13.根據權利要求1所述的方法，其中所述非親核緩沖化合物是非親核兩性離子緩沖化合物，并且其中所述緩沖化合物具有在約7至約9之間的pKa。

14.根據權利要求1所述的方法，其中所述非親核緩沖化合物是非親核陽離子緩沖化合物。

15.根據權利要求1所述的方法，還包括通過質譜檢測來分析所述多種標記的葡基胺。