[發(fā)明專(zhuān)利]一種短DNA片段3’端生物素標(biāo)記的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210440516.2
• 申請(qǐng)日: 2022-04-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN115058469A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-09-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐馳;白永生;莫蓓莘;唐玉林;史禮煜
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 深圳大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12P19/34
• 分類(lèi)號(hào): C12P19/34;C12Q1/6816
• 代理公司: 北京市誠(chéng)輝律師事務(wù)所 11430
• 代理人: 范盈

本發(fā)明公開(kāi)了一種短DNA片段3’端生物素標(biāo)記的方法，包括：(1)以待標(biāo)記DNA片段單鏈為短鏈，設(shè)計(jì)與短鏈部分互補(bǔ)的DNA單鏈為長(zhǎng)鏈，所述長(zhǎng)鏈從5’端到3’端方向包括第一序列和第二序列，所述第一序列與短鏈互補(bǔ)，且第一序列與短鏈互補(bǔ)配對(duì)后在第一序列5’端留出一個(gè)A堿基；(2)配制DNA標(biāo)記的反應(yīng)體系；(3)利用PCR儀進(jìn)行DNA標(biāo)記反應(yīng)。本發(fā)明通過(guò)普通taq酶在短DNA片段3’端快速標(biāo)記上生物素的方式，快速便捷地獲得用于檢測(cè)microRNA的Northern blot探針。該方法操作簡(jiǎn)單方便，周期短，成本低，實(shí)用性強(qiáng)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種短DNA片段3’端生物素標(biāo)記的方法。

背景技術(shù)

DNA探針標(biāo)記是分子生物學(xué)和基因工程研究中一種重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如用帶有生物素標(biāo)記的探針去檢測(cè)某個(gè)基因的表達(dá)。探針一般可由生物公司直接合成帶有標(biāo)記的引物(單鏈DNA)，或者購(gòu)買(mǎi)相關(guān)試劑盒(參考碧云天EMSA探針生物素標(biāo)記試劑盒貨號(hào)GS008)對(duì)合成的引物進(jìn)行標(biāo)記。但是生物公司直接合成帶有標(biāo)記的探針價(jià)格昂貴、周期較長(zhǎng)且合成的一個(gè)只能單一使用；而利用購(gòu)買(mǎi)的現(xiàn)有試劑盒進(jìn)行標(biāo)記核酸互補(bǔ)序列，雖然周期較短，可靈活標(biāo)記不同探針，但是受限于目前試劑盒的價(jià)格依然較貴、且次數(shù)有限以及步驟繁瑣等。

因此，開(kāi)發(fā)一種快速、低成本的利用生物素標(biāo)記的DNA探針?lè)椒ň哂兄匾饬x。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明旨在提供一種短DNA片段3’端生物素標(biāo)記的方法，該方法利用Taq酶能夠從5’→3’端進(jìn)行復(fù)制且耐高溫的特性，設(shè)計(jì)與待標(biāo)記DNA單鏈部分互補(bǔ)的長(zhǎng)鏈DNA單鏈，且利用長(zhǎng)鏈和短鏈部分互補(bǔ)并在末尾留出與U互補(bǔ)的A堿基(見(jiàn)模式圖1)，使得強(qiáng)制給短鏈3’端添加上帶有生物素的U。具體技術(shù)方案如下：

本發(fā)明第一方面提供一種短DNA片段3’端生物素標(biāo)記的方法，包括如下步驟：

(1)以待標(biāo)記DNA片段單鏈為短鏈，設(shè)計(jì)與短鏈部分互補(bǔ)的DNA單鏈為長(zhǎng)鏈，所述長(zhǎng)鏈從5’端到3’端方向包括第一序列和第二序列，所述第一序列與短鏈互補(bǔ)，且第一序列與短鏈互補(bǔ)配對(duì)后在第一序列5’端留出一個(gè)A堿基；

(2)配制DNA標(biāo)記的反應(yīng)體系；

(3)利用PCR儀進(jìn)行DNA標(biāo)記反應(yīng)，反應(yīng)條件如下，反應(yīng)結(jié)束后，即得3’端生物素標(biāo)記的DNA片段；

進(jìn)一步地，所述短鏈的長(zhǎng)度為18-24bp；

所述長(zhǎng)鏈的長(zhǎng)度為50-59bp。

進(jìn)一步地，所述短鏈的濃度為5-10mM；

所述長(zhǎng)鏈的濃度為5-10mM。

進(jìn)一步地，所述Taq酶選自rTaq。

本發(fā)明第二方面提供一種DNA 3’端生物素標(biāo)記的試劑盒，其包括Taq酶、Taq酶Buffer、Biotin-11-dUTP和RNase free H₂O。

進(jìn)一步地，所述試劑盒用于DNA 3’端生物素標(biāo)記的操作如上述方法所述。

本發(fā)明第三方面提供短DNA片段3’端生物素標(biāo)記的方法或DNA 3’端生物素標(biāo)記的試劑盒在Northern blot DNA探針生物素標(biāo)記中的應(yīng)用；

進(jìn)一步地，所述Northern blot DNA探針用于檢測(cè)microRNA的含量。

本發(fā)明的有益效果為：