[發明專利]一種人多能干細胞來源的Müller細胞的制備方法

在審

• 申請號: 202210432103.X
• 申請日: 2022-04-22
• 公開（公告）號: CN114807034A
• 公開（公告）日: 2022-07-29
• 發明（設計）人: 鐘秀風;鄭丹丹;寧蓉;彭福華
• 申請（專利權）人: 中山大學中山眼科中心
• 主分類號: C12N5/079
• 分類號: C12N5/079;C12N5/074;A01N1/02
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 朱聰聰;劉明星

本發明公開了一種人多能干細胞來源的Müller細胞的制備方法，屬于細胞生物學技術領域。本發明方法包括以下步驟：將人多能干細胞誘導分化獲得三維視網膜類器官；將視網膜類器官機械分離獲得神經視網膜片；將獲得的神經視網膜片消化，獲得視網膜單細胞懸液。將獲得的視網膜單細胞懸液，在Müller細胞培養基中貼壁培養，去除非Müller細胞，獲得人多能干細胞來源的人Müller細胞，并進行傳代擴增及凍存。利用本發明方法獲得的人Müller細胞，彌補人組織分離Müller細胞的局限性；經鑒定，本發明獲得的Müller細胞不存在其它視網膜細胞及星形膠質細胞等非Müller細胞的污染，純度高；來源于誘導分化晚期如第120天之后的視網膜類器官的Müller細胞，可連續擴增10代以上，短期內可生產大量細胞，并且可通過簡單的方法進行冷凍保存，為人類Müller細胞在生理病理狀態下的特征及功能研究，以及視網膜疾病損傷修復研究等提供有用的細胞工具或種子細胞。

技術領域：

本發明屬于細胞生物學技術領域，具體涉及一種人多能干細胞來源的Müller細胞的制備方法。

背景技術：

Müller細胞是脊椎動物視網膜的主要神經膠質細胞，在視網膜中發揮著重要的生理功能，包括血視網膜屏障的形成，維持視網膜的完整性等。它們還可為視網膜神經元提供神經營養、代謝和抗氧化支持，并通過神經遞質循環調節神經元活動，具有神經保護作用(Bringmann等，2009年；Eastlake等，2020年；Reichenbach和Bringmann，2013年)。

目前，一些低等動物模型中的研究表明，在病理條件下，Müller細胞可以去分化形成具有分化獲得其他視網膜細胞類型潛能的視網膜前體樣細胞，補充修復病理條件下受損的神經元(Raymond等，2006年)。因此，十幾年間，科學家們努力探索Müller細胞的再生潛力及其機制，期望利用Müller細胞建立治療晚期神經視網膜病變的新策略。人們發現，在多種類型的人類視網膜疾病中，例如糖尿病性視網膜病變和視網膜退行性疾病中，Müller細胞會被各種致病性刺激(例如缺氧)激活(Bringmann等，2006年)。Müller細胞的輕微激活可能可以促進視網膜神經元的存活從而修復視網膜。但是持續的激活也可能導致形成反應性膠質增生，膠質瘢痕，加速視網膜神經退行性病變，嚴重阻礙視網膜修復。但是目前在人類視網膜，Müller細胞是否存在再生能力，再生相關的機制，能否修復損傷的視網膜，臨床治療轉化等問題仍然不清楚，亟需進行大量的臨床前研究。

然而，由于人體難以像動物模型一樣進行在體實驗，過去的人Müller細胞相關實驗主要是通過對臨床患者的觀察，大大妨礙了人Müller細胞相關研究的進展。并且由于人類組織細胞來源有限，人類Müller細胞難以大量獲取，Müller細胞的生理特征仍然不是很清楚。此外，迄今為止，人Müller細胞主要從人尸體供體和玻璃體視網膜手術后剩余的樣本中分離獲得(Limb等，2002年；Lawrence等，2007年)。然而在成人視網膜中，與Müller細胞具有許多共同特征的星形膠質細胞也存在于視網膜神經纖維層中，干擾Müller細胞的擴增和純化(Lawrence等,2007年)。另外，來源于人供體組織的Müller細胞容易有免疫排斥和疾病傳播的風險，不適合未來的臨床應用(Eastlake等，2019年)。

人多能干細胞的快速發展使得解決上述問題成為可能。科學家們已經可以通過人多能干細胞產生三維視網膜類器官，這些類器官能夠重現人視網膜發育并形成包含所有視網膜細胞類型的視網膜組織(Zhong等,2014年；Li等，2018年；Guan等，2021年)。研究表明，Müller細胞是唯一與視網膜神經元共享共同視網膜前體細胞的膠質細胞類型，它們可以在人多能干細胞衍生的視網膜類器官中出現并存活(Zhong等，2014年；Fligor等，2018年；Capowski等，2019年；Singh等，2021年)。

發明內容：

由于人視網膜中Müller細胞具有許多重要功能，本發明的目的是提供一種人多能干細胞來源的Müller細胞的制備和擴增培養方法，為Müller細胞的病理生理特征及機制研究，Müller細胞相關疾病的研究和治療等提供豐富的種子細胞。