[發明專利]一種從薔薇屬植物組織中提取總RNA的方法

在審

• 申請號: 202210415469.6
• 申請日: 2022-04-20
• 公開（公告）號: CN114774406A
• 公開（公告）日: 2022-07-22
• 發明（設計）人: 田雪軍;韋如健;陳士;李仔葉;吳晶晶;李昊璞;徐佩琪;徐艷;熊興鵬
• 申請（專利權）人: 荊楚理工學院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C40B40/06
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

本發明公開了一種從薔薇屬植物組織中提取總RNA的方法。具體地公開了一種從薔薇屬植物組織中提取總RNA的方法，所述方法包括將薔薇屬植物組織經液氮研磨后，進行連續三次裂解和提取的步驟，所述三次裂解和提取分別采用溶液A、溶液B和溶液C進行裂解，并公開了溶液A、溶液B和溶液C的組分。本發明方法有效解決了次生代謝物質、蛋白質、和DNA等對RNA提取的干擾問題，顯著提高了薔薇屬植物組織總RNA的提取質量和效率。本發明方法具有高效率、高質量、低成本、周期短、穩定好、操作簡單和易于廣泛應用等優點，提取的總RNA完整性好、純度高、得率高，可直接用于RT?PCR、cDNA文庫構建等下游分子生物學實驗。

技術領域

本發明屬于植物分子生物學技術領域，具體涉及一種從薔薇屬植物根、莖、葉、花、果實等組織中提取高質量總RNA的方法。

背景技術

植物組織總RNA的提取是開展基因的克隆、表達、功能及調控等分子生物學研究的實驗基礎。純度高且完整性好的高質量總RNA是進行RT-PCR、RT-qPCR、Northern雜交、cDNA文庫構建和轉錄組學分析等分子生物學實驗的關鍵。RNA是一類極易降解的分子，要得到完整的RNA，必須最大限度地抑制提取過程中內源性及外源性核糖核酸酶(ribonuclease，RNase)對RNA的降解，而且植物組織RNA的提取較動物和微生物困難，如酚類物質氧化后可使RNA活性喪失，多糖可形成難溶膠狀物質與RNA一起被沉淀，所以細胞內RNA分子的多樣性和易被降解決定了其提取過程的復雜性。目前植物組織總RNA的提取方法有很多，如常規的Trizol法、CTAB法、SDS法等通常用于普通植物組織總RNA的提取，針對復雜植物組織總RNA的提取，現在雖然也有一些改良的方法(如改良Trizol法、改良CTAB法、改良SDS法等)能夠從一些復雜植物組織中成功地提取出總RNA，但是由于植物的多樣性，不同植物或相同植物的不同組織中干擾總RNA分離純化的因素各不同，因此需要根據植物材料的具體特點開發有針對性的RNA提取方法，從而獲得高質量的植物組織總RNA。

薔薇屬(Rosa L.)植物多為直立、蔓延或攀援灌木，是世界著名的園林觀賞植物，其組織中不僅富含多糖、多酚、有機酸類、黃酮類、萜醇類、皂苷類、鞣質、色素等次生代謝物質，而且RNase活性較高，造成RNA提取過程的難分離、褐化、氧化和降解，導致從中提取高質量的總RNA一直比較困難。目前已報道的關于薔薇屬植物組織總RNA的提取方法僅單一適用于幼嫩葉、幼嫩根或花瓣，而適用于薔薇屬植物各個組織的總RNA提取方法還未見報道。趙小蘭等(2005)采用LiCl-尿素法和CTAB酸酚法分別提取了多花薔薇幼嫩葉和幼嫩根的總RNA。謝吉容等(2007)采用CTAB多級沉淀法和改良異硫氰酸胍法提取了月季花瓣的總RNA。蔣昌華等(2008)采用天澤基因工程有限公司生產的植物RNAout提取試劑盒提取了月季剛展開嫩葉的總RNA。馮立國等(2013)采用改良CTAB法提取了玫瑰花組織的總RNA。申請者通過多次實驗發現這些方法對于樣品中次生代謝物質的去除不徹底，且RNA提取質量和效率低，穩定性差，廣譜性小，不能滿足RT-PCR、RT-qPCR、Northern雜交、cDNA文庫構建和轉錄組學分析等分子生物學實驗操作的需要，同時申請者查閱文獻，也未見這些方法后續的廣泛和大量應用。另外，現今市場上出售的多糖多酚植物組織總RNA提取試劑盒，雖然可以從薔薇屬植物組織中提取高質量的總RNA(劉航程等，2021)，但總RNA的完整性不佳，得率較低，且成本高，僅適合少量RNA的提取。因此，隨著薔薇屬植物分子生物學研究的深入，迫切需要一種成本低廉、操作簡便、穩定性好、效率高、具有廣譜性的從薔薇屬植物組織中提取高質量總RNA的方法。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是如何簡便、穩定、高效、廣譜和/或成本低廉地從薔薇屬植物組織中提取純度高、完整性好的高質量總RNA，和/或，解決基因組DNA、蛋白質及次生代謝物質對薔薇屬植物組織總RNA提取的干擾問題。所要解決的技術問題不限于所描述的技術主題，本領域技術人員通過以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技術主題。