[發明專利]一種棕色脂肪細胞來源的外泌體及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202210413680.4
• 申請日: 2022-04-20
• 公開（公告）號: CN114517187A
• 公開（公告）日: 2022-05-20
• 發明（設計）人: 金萬洙;葉榮財
• 申請（專利權）人: 中國科學院動物研究所
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/12;C12N15/867;A61K35/35;A61P19/02;A61P29/00
• 代理公司: 北京鴻元知識產權代理有限公司 11327
• 代理人: 溫劍

本發明公開一種棕色脂肪細胞來源的外泌體及其制備方法和應用，屬于分子生物學技術領域。本發明提供的外泌體的制備方法包括構建共表達PPARγ和CEBPβ的人源皮膚成纖維細胞，得到棕色脂肪前體細胞；利用棕色脂肪細胞誘導分化培養基對棕色脂肪前體細胞進行誘導分化培養，獲得棕色脂肪細胞；使棕色脂肪細胞分泌外泌體，獲得棕色脂肪細胞來源的外泌體。本發明提供的外泌體可以通過外敷給藥方式治療關節炎疼痛癥狀，因此可用于制備治療關節炎相關病癥的藥物。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種人源皮膚成纖維細胞（HEF細胞）轉分化的棕色脂肪細胞來源的外泌體及其制備方法和應用。

背景技術

關節炎癥狀包括一處或多處關節出現炎癥，主要癥狀為關節疼痛、僵硬、活動受限，關節皮膚發熱發紅，肌無力和肌萎縮等，其病因尚未完全清楚，但已知與多因素有關，包括先天遺傳因素、后天環境因素、年齡、性別、肥胖、關節損傷、關節過度使用等。

根據最新的流行病學研究表明，我國至少有關節炎患者約6千萬人，而且患病人數逐漸增加。關節炎不僅影響患者的生活質量，如此大的患病基數也對社會以及國民生產造成了極大的負擔。目前，針對關節炎的治療方案都存在一定的毒副作用或者創傷式損傷缺陷。因此，如何通過無創和安全的方式讓關節炎患者受益，是目前關注的重點。

隨著干細胞研究的深入以及生物工程技術的普遍應用，越來越多的研究者探索這一技術在關節炎治療領域中的應用，逐漸展現了較為樂觀的應用前景。然而，現有干細胞治療關節炎的方式多為病患處原位注射干細胞，但注射方式為有創治療，其必然會存在一定的風險，包括局部出血、血腫等，尤其當無菌操作不當時，可能會造成局部感染。另外，若注射不當，還可能會造成局部組織栓塞，導致局部組織壞死等。

發明內容

針對現有技術中存在的一個或多個問題，本發明一個方面提供一種棕色脂肪細胞來源的外泌體的制備方法，其包括以下步驟：

S1：構建共表達PPARγ和CEBPβ的人源皮膚成纖維細胞，得到棕色脂肪前體細胞；

S2：利用棕色脂肪細胞誘導分化培養基對步驟S1獲得的棕色脂肪前體細胞進行誘導分化培養，獲得棕色脂肪細胞；

S3：使步驟S2獲得的棕色脂肪細胞分泌外泌體，獲得棕色脂肪細胞來源的外泌體。

在一些實施方式中，步驟S1中所述構建共表達PPARγ和CEBPβ的人源皮膚成纖維細胞的操作為：

S11：分別構建表達PPARγ和CEBPβ的慢病毒表達載體，得到PPARγ慢病毒表達載體和CEBPβ慢病毒表達載體；

S12：分別對步驟S11構建獲得的PPARγ慢病毒表達載體和CEBPβ慢病毒表達載體進行慢病毒包裝，得到表達PPARγ的慢病毒和表達CEBPβ的慢病毒；

S13：使用步驟S12獲得的表達PPARγ的慢病毒和表達CEBPβ的慢病毒對人源皮膚成纖維細胞進行慢病毒感染，得到所述棕色脂肪前體細胞。

在一些實施方式中，步驟S1中所述PPARγ和CEBPβ的編碼序列分別如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

在一些實施方式中，步驟S2中所述棕色脂肪細胞誘導分化培養基的配方包括：體積百分含量為97%-99%的高糖DMEM、體積百分含量為1%-3%的胎牛血清、32-34 μM的生物素、0.4-0.6 μM的胰島素、16-18 μM的泛酸、0.09-0.11 μM的DEX、1-3 μM的T3、0.50-0.60 mM的IBMX和0.02-0.04 mM的吲哚美辛。

在一些實施方式中，步驟S2中所述誘導分化培養的時間為6天以上。

在一些實施方式中，步驟S2中所述誘導分化培養的條件為5%CO₂，37±1℃。

在一些實施方式中，步驟S3中所述使步驟S2獲得的棕色脂肪細胞分泌外泌體的操作為使用無血清基礎培養基對所述棕色脂肪細胞進行培養。