[發明專利]一種脫水四環素誘導的大腸桿菌-枯草芽孢桿菌通用型誘導表達系統

有效

• 申請號: 202210402398.6
• 申請日: 2022-04-18
• 公開（公告）號: CN114645062B
• 公開（公告）日: 2023-09-08
• 發明（設計）人: 劉龍;陳堅;呂雪芹;堵國成;李江華;劉延峰;李洋;武耀康
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/75;C07K14/245;C12N15/31;C07K14/435;C12R1/19;C12R1/125
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 趙巧娜

本發明公開了一種脫水四環素誘導的大腸桿菌?枯草芽孢桿菌通用型誘導表達系統，屬于基因工程領域。本發明構建了在大腸桿菌與枯草芽孢桿菌中均可使用脫水四環素誘導表達的操縱子Psubgt;tet/subgt;表達系統，該系統以商業化質粒pHT01為表達載體，包括阻遏蛋白tetR表達框和超級折疊綠色熒光蛋白(sfGFP)表達框。其中對阻遏蛋白tetR表達框中的阻遏蛋白tetR的基因序列和RBS序列進行突變以改變阻遏蛋白親和力和表達強度。操縱子Psubgt;tet/subgt;表達系統在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中均表現出低泄漏和高的誘導放大倍數。因此本通用表達系統結構簡單、活性高、調控嚴謹，在異源蛋白高效表達和合成生物學研究中有廣闊的應用前景。

技術領域

本發明了涉及一種脫水四環素誘導的大腸桿菌-枯草芽孢桿菌通用型誘導表達系統，屬于基因工程學領域。

背景技術

枯草芽孢桿菌作為一類革蘭氏陽性菌，由于其良好的生物安全性，較強的分泌能力，無密碼子偏好性而被廣泛應用與各種蛋白酶制劑和有價值的蛋白質的生產。枯草芽孢桿菌表達異源蛋白存在多種表達系統，以不同啟動子特性來分，主要有自誘導表達系統、組成型表達系統、誘導型表達系統。啟動子從功能上主要分為組成型啟動子和誘導型啟動子兩類。組成型啟動子在菌體的生長各個階段都可以表達外源基因，而誘導型啟動子在沒有被誘導時表現無活性或者低活性，在加入誘導劑之后啟動子的活性大幅提高進而高效表達外源基因。誘導型啟動子由于其活性可控而被廣泛應用，人們可以通過調控加入誘導劑的試劑和濃度控制外源基因的表達時間和強度。

目前在枯草芽孢桿菌當中應用較為廣泛的主要有IPTG誘導系統和木糖誘導系統。其中，IPTG誘導系統主要基于pHT系列載體構建而成，使用的是非天然的雜合啟動子和大腸桿菌的LacI阻遏蛋白和結合位點；而木糖誘導系統通常使用天然的PxylA啟動子和XylR阻遏蛋白。雖然IPTG、木糖等誘導系統在枯草芽孢桿菌中被廣泛使用，但由于木糖是碳源會被利用、IPTG對人體有毒、表達強度有限、在大腸桿菌中是組成型表達無法誘導等缺點，在實際使用中均出現一定的問題；如在表達一些對菌體產生毒性的蛋白時，在大腸桿菌中的泄漏表達經常使基因序列發生突變而提前終止表達，無法構建大腸-枯草通用誘導調控系統。

因此，需要開發一種基于新型誘導劑、調控嚴謹、在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中通用的誘導型表達系統，對后續酶工程、代謝工程等領域打下基礎。

發明內容

枯草芽孢桿菌中常用的IPTG、木糖等誘導系統在大腸桿菌中組成型表達無法誘導，不利于蛋白表達載體的構建與調控系統的構建；通用誘導型表達系統要求阻遏蛋白要在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中表現出足夠的親和強度和表達強度以降低啟動子的泄漏使調控更嚴謹。

本發明提供了一種阻遏蛋白tetR表達框，所述表達框由啟動子P21、RBS序列和阻遏蛋白tetR構成；所述啟動子P21的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示，所述RBS序列的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4或SEQ?ID?NO.9所示，所述阻遏蛋白tetR的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，或阻遏蛋白為，將氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示的阻遏蛋白tetR的第119位的苯丙氨酸突變為酪氨酸得到的。

本發明還提供了一種表達系統，所述表達系統由表達載體、上述表達框及目的基因構成，所述目的基因含有P_tet啟動子。

在本發明的一種實施方式中，所述目的基因包括但不限于超級折疊綠色熒光蛋白、綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、藍色熒光蛋白、β-葡萄糖醛酸苷酶、β-半乳糖苷酶或參與微生物代謝調控的基因。

在本發明的一種實施方式中，所述表達載體包括但不限于pHT01質粒、pSTOP1622質粒、pJOE8999質粒或pAD123質粒。

在本發明的一種實施方式中，所述P_tet啟動子核苷酸序列如SEQ?ID?NO.7所示。