[發明專利]一種檢測ctDNA的恒溫無酶系統的構建及其應用

在審

• 申請號: 202210388045.5
• 申請日: 2022-04-14
• 公開（公告）號: CN114774543A
• 公開（公告）日: 2022-07-22
• 發明（設計）人: 譚凱月;鄒麗麗;呂倩;楊澤銳
• 申請（專利權）人: 廣東省科學院生物與醫學工程研究所
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 齊鍵

本發明公開了一種檢測ctDNA的恒溫無酶系統的構建及其應用。該恒溫無酶系統基于發夾序列H₁、發夾序列H₂和Reporter?F和Reporter?Q構成，發夾序列H₁和發夾序列H₂在目標ctDNA的引發下，相互雜交形成穩定的雙鏈DNA復合物(H₁?H₂)。Reporter?F與發夾序列H₁的序列D部分互補配對，且配對堿基數大于與Reporter?Q的配對堿基數。本發明中的恒溫無酶系統對于ctDNA的檢測限可以達到7pM，具有較高的信號增益、低背景、較好的選擇性和特異性以及較好的血清穩定性，為乳腺癌的早期篩查提供了有效的技術支持。

技術領域

本發明屬于基因檢測領域，具體涉及一種檢測ctDNA的恒溫無酶系統的構建及其應用。

背景技術

循環腫瘤DNA(ctDNA)是由腫瘤細胞在凋亡或壞死過程中釋放到血液中的基因組片段，攜帶有腫瘤特異性的遺傳學信息。ctDNA通常由90～150個核苷酸構成。ctDNA具有組織特異性，在乳腺癌患者的血清中異常表達。此外，ctDNA在血液中的半衰期較短，一般小于2h，而大多數蛋白生物標志物的半衰期可達數周。因此，ctDNA更能反饋腫瘤的實時狀態信息。作為液體活檢的有效腫瘤標志物，ctDNA檢測可以為乳腺癌的早期診斷和病理分型提供重要的、準確可靠的理論和實驗證據。但ctDNA作為腫瘤標志物在乳腺癌患者血清中的豐度很低，對于現有的ctDNA檢測帶來了一定的困難。因此需要發展一種檢測效果更加準確且檢測限更低的ctDNA檢測方法以用于實際的ctDNA檢測中。

相關技術中，用于ctDNA檢測的信號擴增方法主要有逆轉錄聚合酶鏈式擴增(RT-PCR)、DNA測序和酶輔助的信號擴增。其中，RT-PCR方法操作繁瑣，需要嚴格設計引物并依賴精密的循環溫控儀器。DNA測序方法操作耗時，通常需要2-3周，成本比較高。而對于酶輔助的信號擴增，雖然酶輔助的信號擴增中酶的活性比較高，但它需要嚴格控制酶的活性，操作環境比較苛刻，且制備過程復雜、繁瑣，因此其應用受到較大的限制。

發明內容

本發明旨在至少解決上述現有技術中存在的技術問題之一。為此，本發明提出一種檢測ctDNA的恒溫無酶系統的構建及其應用。本發明中的用于檢測ctDNA的恒溫無酶系統檢測時間短、操作便捷且靈敏度高，且具有較高的信號增益、低背景、較好的選擇性和特異性以及較好的血清穩定性，通過該系統能夠有效實現血清中豐度較低的腫瘤標志物ctDNA的高靈敏度檢測，從而獲得癌癥早期診斷的ctDNA表達譜特征，為癌癥的早期診斷提供堅實的技術支持。

本發明的第一個方面，提供一種ctDNA檢測探針組，該ctDNA檢測探針組包括發夾序列組和報告序列組；

所述發夾序列組包括發夾序列H₁和發夾序列H₂；

所述發夾序列H₁包括序列A，序列B，序列C和序列D；

所述序列A和序列B靶向結合目標ctDNA；

所述發夾序列H₂包括序列E和序列F；所述序列E與所述序列B和序列C互補配對，且序列C的堿基數大于序列A的堿基數；

所述發夾序列H₁和發夾序列H₂在目標ctDNA的引發下，相互雜交形成穩定的雙鏈DNA復合物(H₁-H₂)；

所述報告序列組包括Reporter-F和Reporter-Q；

所述Reporter-F與Reporter-Q互補配對；

所述Reporter-F與所述序列D互補配對，且配對堿基數大于與Reporter-Q的配對堿基數。