[發明專利]一種ω-轉氨酶突變體及其在制備西塞卡納藥物中間體的應用

在審

• 申請號: 202210371099.0
• 申請日: 2022-04-08
• 公開（公告）號: CN114645030A
• 公開（公告）日: 2022-06-21
• 發明（設計）人: 黃俊;曹佳仁;邱帥;梅樂和;呂常江;樊芳芳;胡升;趙偉睿
• 申請（專利權）人: 浙江科技學院
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/70;C12N1/21;C12P13/00;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 沈金龍

本發明公開了一種ω?轉氨酶突變體及其在制備西塞卡納藥物中間體的應用，涉及分子生物學技術領域。一種ω?轉氨酶突變體，由來自土曲霉(Aspergillus terreus)的ω?轉氨酶突變所得，野生型ω?轉氨酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述ω?轉氨酶突變體的突變位點為：V149A/R128L/L182V/D224K、V149A/R128L/L182F/D224K或V149A/L182F/L187F/D224K中的至少一種。本發明基于一種催化口袋疏水氨基酸的位阻效應，確定需要突變的氨基酸殘基位點，結合高通量顯色的定量篩選方法，通過定點突變技術進行實驗驗證，該方法可有效地提高突變氨基酸位點的篩選概率，提高實驗效率及可行性，并篩選得到熱力學穩定性、酶活性明顯優于野生酶的突變酶。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，具體涉及一種ω-轉氨酶突變體及其在制備西塞卡納藥物中間體的應用。

背景技術

手性胺由于其高密度的氫鍵的形成和精細的生物活性，逐漸成為許多醫藥領域的關鍵組成部分藥物。手性胺經常用于合成手性藥物，如阿爾茨海默病藥物卡巴拉汀、腎上腺素能拮抗劑地來洛爾、抗逆轉錄病毒藥物洛匹那韋、糖尿病藥物西他列汀等。這些手性化合物的應用藥物極大地促進了高效合成藥物的探索手性胺。

(R)-1-(1-萘基)乙胺(R-NEA)是一種重要的手性芳香胺，是重要的醫藥中間體和中間體手性拆分劑。例如，R-NEA和3-(3-三氟甲基苯基)-丙酸可以進行酰胺偶聯用于生產擬鈣劑鹽酸西那卡塞用于治療與甲狀旁腺癌相關的繼發性甲狀旁腺功能亢進和高鈣血癥。此外，(R)-和(S)-1-(1-萘基)乙胺可吸附在聚結晶鉑表面，制備高活性手性催化劑。與傳統的化學合成方法相比，生物催化是光活性胺合成的綠色替代方法。生物催化劑通常在環境溫度和中性pH下運行在水介質中，催化手性中間體的生物合成高效可行的方式。在過去幾十年里，各種已經探索了用于手性胺合成的酶，如胺脫氫酶、單胺氧化酶、還原性氨基酶、亞胺還原酶、氨解酶和轉氨酶。

轉氨酶是催化某基團從供體化合物轉移到受體化合物上的一類酶，可以通過簡單的催化劑里，可逆地將來源于氨基酸供體的氨基轉移到氨基酸受體上。目前，在不對稱合成手性胺類化合物及胺類化合物外消旋體拆分中，轉氨酶都是關鍵的生物技術酶。由于其不對稱催化合成手性胺的特點，轉氨酶已成為工業上用于生產氨基酸、手性胺、氨基醇和氨基糖等重要農藥或醫藥中間體的常用酶之一。來自于土曲霉屬(Aspergillus terreus)的ω-轉氨酶以酮類化合物為原料，通過立體選擇性地轉氨基作用，可以高效生產手性胺，催化氨基供體上的氨基轉移到前手性的受體酮，得到手性胺和副產物酮，反應過程需要磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate，PLP)的參與，實驗表明，ω-轉氨酶野生型在40℃下的半衰期僅為6.9min，不利于應用到工業生產中，其熱穩定性有待進一步提高。如CN105441404A、CN105950581A公開了利用定點突變技術對ω-轉氨酶野生型進行改造，獲得熱穩定性進一步提高的ω-轉氨酶突變體，使其更適合工業應用。

轉氨酶在合成手性胺方面具有較好的應用前景，但由于野生型酶在底物特異性、穩定性、催化效率等方面存在諸多不足，目前滿足工業應用需求的轉氨酶仍較為有限。基于非理性、理性及半理性設計策略的蛋白質工程技術能有效改善轉氨酶的應用性能，為手性胺的高效制備提供了可能。隨著轉氨酶蛋白結構和催化機制相關研究的深入，利用理性或半理性設計策略對轉氨酶進行分子改造的研究備受關注。

目前尚無利用轉氨酶催化口袋疏水氨基酸位阻效應結合對硝基苯乙胺的顯色反應，進而利用定點突變技術進行改造方法來提高土曲霉屬(Aspergillus terreus)ω-轉氨酶熱穩定性的相關研究報道。

發明內容

本發明提供了一種ω-轉氨酶突變體及其在制備西塞卡納藥物中間體的應用，旨在篩選出熱穩定性和酶活極大提高的土曲霉(Aspergillus terreus)ω-轉氨酶突變體。