[發明專利]一種豬藍耳類NADC30毒株的熒光探針引物、試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 202210368664.8
• 申請日: 2022-04-08
• 公開（公告）號: CN114717361A
• 公開（公告）日: 2022-07-08
• 發明（設計）人: 張蓉;毛旭明;沈俊杰;凌勇;丁能水;萬文峰;龍毅;施建軍;吳有林
• 申請（專利權）人: 漳州傲農現代農業開發有限公司;泰和縣傲牧育種有限公司;金華市宏業畜牧養殖有限公司;福建傲農生物科技集團股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12N15/11;C12Q1/6851
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 褚明偉

本發明涉及生物學分子技術領域，尤其是涉及一種豬藍耳類NADC30毒株的熒光探針引物、試劑盒及其應用。本發明選擇NADC30?like、Jxa 1、GM2、XHGD基因組的保守序列之間同源性較低的序列設計探針引物，本發明試劑盒可以同時進行大批量的樣本分析，一次檢測即可鑒別樣本中是否有類NADC30毒株，且本發明提供一種豬源型內參，能夠滿足檢測豬源樣品時內控核酸檢測的要求，避免假陰性結果，具有簡便快捷、穩定性好、靈敏度高、特異性強的特點。

技術領域

本發明涉及生物學分子技術領域，尤其是涉及一種豬藍耳類NADC30毒株的熒光探針引物、試劑盒及其應用。

背景技術

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV)感染引起的一種以懷孕母豬流產、早產和死胎等繁殖障礙和仔豬、育肥豬呼吸系統紊亂和生長遲緩為主要癥狀的高度接觸性傳染病，是嚴重危害養豬業的傳染病之一。根據毒株間的基因組特性，PRRSV可以分為兩個基因型，即以VR2332株為代表的美洲型和以LV株為代表的歐洲型，2012年起，一類具有非常獨特的遺傳背景，與2008年在美國分離到的美洲型NADC30毒株有很高的核苷酸相似度的PRRSV毒株在我國養豬場廣泛發現，命名為PRRSV類NADC30株，已對我國養豬業造成一定的經濟損失。

PRRSV是一種單鏈RNA病毒，其基因組總長度約為15Kb，基因組的5’端有一個類似于帽子的引導序列，3’端有一個Poly(A)尾序列。病毒基因組中從5’端至3’端有10個互相重疊的開放閱讀框架構成。它們分別是ORF1a、ORF1b、ORF2、ORF2a、ORF3～ORF5、ORF5a、ORF6和ORF7等，ORFs1a和1b編碼非結構蛋白(NSPs)；ORFs 2a、2b、3、4和5編碼囊膜蛋白；ORFs 6和7分別編碼基質蛋白和核蛋白。

nsp2基因長度約為2.9kb，在所有的非結構蛋白中最大，編碼該蛋白的基因常常發生堿基缺失、突變和插入的變異現象，因此，不同病毒株的長度之間存在差異。nsp2抗原表位多，在表位集中區域容易發生基因缺失或突變，因此保守性最差，美洲株和歐洲株中氨基酸序列的同源性僅為32％。

NADC30 like毒株在致病性上比經典毒株弱，但是同樣持續感染，且主要造成母豬流產，流產率較高，對豬場的經濟效應影響較大，同時仔豬感染后，免疫力受到抑制，導致條件性致病菌發病，造成較嚴重呼吸癥狀和繼發感染，臨床癥狀較嚴重且存在較高的死亡率，目前公開的檢測手段如凍干微芯片，制作工藝較為復雜，成本較高。現在生豬養殖處于非洲豬瘟防疫階段和復產關鍵階段，且據報道華南區大部分養殖場感染NADC30 like毒株，因此急需一種成本低且快速便捷的檢測方法對NADC30 like毒株進行監測。

發明內容

為了解決上述問題，本發明的目的是提供一種豬藍耳類NADC30毒株的熒光探針引物、試劑盒及其應用。本發明選擇NADC30-like、Jxa 1、GM2、XHGD基因組的保守序列之間同源性較低的序列設計探針引物，本發明試劑盒可以同時進行大批量的樣本分析，一次檢測即可鑒別樣本中是否有類NADC30毒株，且本發明提供一種豬源型內參，能夠滿足檢測豬源樣品時內控核酸檢測的要求，避免假陰性結果，具有簡便快捷、穩定性好、靈敏度高、特異性強的特點。

本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：

本發明的第一個目的是提供一種豬藍耳類NADC30毒株的引物探針組，所述引物探針組包括：

上游引物NADC30-F：5’-TCCGGAGAACAGGCCTCTT-3’(序列如SEQ ID NO.1所示)；

下游引物NADC30-R：5’-ACCGCACCCGGACTTGATCT-3’(序列如SEQ ID NO.2所示)；