[發(fā)明專利]一株枯草芽孢桿菌BS168感受態(tài)工程菌株及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210365852.5
• 申請日: 2022-04-08
• 公開（公告）號: CN114990035A
• 公開（公告）日: 2022-09-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張廣文;馮賽祥;廖明;林敏;謝倩梅;代繪琳;江金飛;陳愛華
• 申請（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/75;C12N15/65;C12N15/31;A61K35/742;A61K8/99;A61Q19/00;A23L33/135;C12R1/125
• 代理公司: 廣州嘉權(quán)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44205
• 代理人: 薛建強(qiáng)

本發(fā)明公開了一株枯草芽孢桿菌BS168感受態(tài)工程菌株及其應(yīng)用，該枯草芽孢桿菌BS168?P_xylA?comK重組菌株在Amye位點(diǎn)中插入有P_xylA?comK基因，且不含有抗性標(biāo)簽。本發(fā)明中的枯草芽孢桿菌BS168?P_xylA?comK重組菌株相比BS168野生菌株具有更強(qiáng)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效果，能夠兼容各類不同的位點(diǎn)重組，且由于其改造程度低，因此，可作為一種優(yōu)良工程菌株的原始菌株使用。而且該菌株的改造成本低，具有極高的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程菌株的構(gòu)建領(lǐng)域，具體涉及一株枯草芽孢桿菌BS168感受態(tài)工程菌株及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

枯草芽孢桿菌屬于革蘭氏陽性需氧細(xì)菌，其在農(nóng)業(yè)、醫(yī)療、食品生物等技術(shù)以及重組蛋白生產(chǎn)方面具有較廣的應(yīng)用性。但是，在相關(guān)技術(shù)中，雖然枯草芽孢桿菌168(Bacillussubtilis 168)菌株具有形成自然感受態(tài)的能力，但其感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率和成功率仍然較低，這極大的限制了其在蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用，并無形中增加了代謝工程改造的難度。而相關(guān)技術(shù)中另一具有超級轉(zhuǎn)化能力的枯草芽孢桿菌SCK6(ErmR，1A751衍生，lacA::P_xylA-comK)菌株，雖然在一定程度上的相比枯草芽孢桿菌168提高了一定的轉(zhuǎn)化成功率，打磨其內(nèi)含的新霉素抗性基因極大的限制了其作為益生菌，在活菌應(yīng)用方面的前景。同時(shí)，其相比枯草芽孢桿菌168，由于SCK6是一種多基因改造(his nprR2 nprE18△DaprA3△DeglS102△DbglTbglSRV)菌株，因此，也不適合作為優(yōu)良工程菌株的原始菌株，對其實(shí)際應(yīng)用造成了很大的局限性。

因此，開發(fā)一種能夠有效克服上述菌株的缺陷性，具有更廣的適用性和更強(qiáng)的轉(zhuǎn)化成功率的枯草芽孢桿菌感受態(tài)工程菌株對于枯草芽孢桿菌的深度利用具有極為重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在至少解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明提出一株枯草芽孢桿菌BS168感受態(tài)工程菌株及其應(yīng)用，該工程菌株不含抗性標(biāo)簽，且基于常規(guī)的枯草芽孢桿菌168改造獲得，不存在多基因改造，能夠作為優(yōu)良工程菌株的原始菌株使用，且其相比常規(guī)的枯草芽孢桿菌168，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和基因重組效率更高，能高效轉(zhuǎn)化各類質(zhì)粒。

本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供一株枯草芽孢桿菌BS168-P_xylA-comK重組菌株，該枯草芽孢桿菌BS168-P_xylA-comK重組菌株在Amye位點(diǎn)中插入有P_xylA-comK基因。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述枯草芽孢桿菌BS168-P_xylA-comK重組菌株中不含有抗性標(biāo)簽。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述枯草芽孢桿菌BS168-P_xylA-comK重組菌株的核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示。

在本發(fā)明中，所述枯草芽孢桿菌BS168-P_xylA-comK重組菌株不含任何抗性標(biāo)簽，且插入的改造基因少，因此，可以作為優(yōu)良工程菌株的原始菌株使用。而且，發(fā)明人通過試驗(yàn)驗(yàn)證，該枯草芽孢桿菌BS168-P_xylA-comK重組菌株相比原始枯草芽孢桿菌菌株具有更強(qiáng)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和基因重組效率，能夠輕易實(shí)現(xiàn)如Amye位點(diǎn)重組、Upp位點(diǎn)重組等各類基因位點(diǎn)編輯或改造，具有極高的應(yīng)用價(jià)值。

本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供本發(fā)明第一個(gè)方面所述枯草芽孢桿菌BS168-P_xylA-comK重組菌株的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

(1)構(gòu)建pDG1730-P_grac-Phesm重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌BS168，得到枯草芽孢桿菌BS168-Spc-Phesm；