[發(fā)明專利]用于23種人乳頭瘤病毒基因分型檢測的引物探針組合物、試劑盒及檢測方法

在審

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• 申請日: 2022-03-31
• 公開（公告）號: CN114891922A
• 公開（公告）日: 2022-08-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孫艷;陳小音;陳文;郭興中;劉松林;朱小娟
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州丹威生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 杭州君銳知產(chǎn)專利代理事務所(普通合伙) 33443
• 代理人: 方琦

本發(fā)明涉及分子生物學領(lǐng)域，具體涉及一種用于23種人乳頭瘤病毒基因分型檢測的引物探針組合物、試劑盒及檢測方法。本發(fā)明通過在HPV基因序列E6和L1兩個不同區(qū)域分別設(shè)計水解探針和分子信標探針、并將擴增階段的熒光采集點設(shè)置于高溫變性階段，使得擴增階段和熔解曲線兩個階段的檢測相互獨立而互不干擾，從而實現(xiàn)了實時熒光PCR擴增檢測技術(shù)與熔解曲線技術(shù)的聯(lián)合使用；該技術(shù)提高了熒光PCR分析技術(shù)的單孔檢測目標通量，降低了檢測成本，為HPV多重熒光PCR分型檢測提供一個更優(yōu)的檢測方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學領(lǐng)域，具體涉及一種用于23種人乳頭瘤病毒基因分型檢測的引物探針組合物、試劑盒及檢測方法。

背景技術(shù)

人乳頭瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)屬于乳頭多瘤空泡病毒科(Papovaviridae)乳頭瘤病毒屬，HPV主要通過直接或間接接觸污染物或性傳播感染人類。HPV不但具有宿主特異性，而且具有組織特異性，只能感染人的皮膚和粘膜上皮細胞，引起人類皮膚的多重乳頭瘤或疣以及粘膜生殖道上皮增生性損傷。持續(xù)HPV感染是導致宮頸癌和一些生殖器瘤樣病變的主要原因。

對于感染生殖道和肛門的HPV，根據(jù)各基因型別致病力大小或致癌危險性分為高危型與低危型兩大類。感染高危型HPV是發(fā)生宮頸鱗狀細胞癌必要但不充分條件。因此，僅有很少一部分感染HPV的女性會發(fā)展為明確的宮頸病變或?qū)m頸癌。在小于 30歲的女性中，雖然HPV感染率很高，但自主清除率也很高，因此對細胞學檢查正常但HPV檢測結(jié)果陽性的女性不建議做過多治療，避免負面后果，如花費增加，并有影響生育的可能。實際上大多數(shù)HPV感染是一過性的，進展的風險很小，僅有一少部分感染是持續(xù)性的。目前對于決定HPV持續(xù)感染的因素尚無充分的認識，但無論年齡因素，持續(xù)感染高危型1年或2年則預計有顯著的后續(xù)發(fā)生宮頸上皮內(nèi)瘤變 (CIN)3級或?qū)m頸癌風險。研究表明：HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52， 56，58，59和68為HPV高危型別，HPV26，53，66，73，82為中等風險型別，其中HPV16型和宮頸癌發(fā)生的相關(guān)性最大，HPV18次之。目前已知增加HPV持續(xù)感染機會的協(xié)同因素包括吸煙、免疫系統(tǒng)受損、HIV病毒感染等。由HPV感染引起的相關(guān)性宮頸腫瘤的進展比較緩慢，重度不典型增生進展為宮頸浸潤癌，平均需要3-7 年，因此HPV感染的患者適于進行頻率較低的檢查。此外，HPV在體外不能增殖，故不能用培養(yǎng)法檢測。傳統(tǒng)方法主要是通過形態(tài)學與免疫學方法對其進行檢測，但特異性和靈敏度不夠理想，且不能對HPV進行分型，因而分子生物學的方法是目前 HPV分型檢測的主要技術(shù)。

目前HPV基因分型檢測方法，如1)原位雜交技術(shù)：以核酸探針(DNA或RNA) 與樣本進行原位雜交反應，原位雜交的優(yōu)點是可對可疑細胞進行定位，同時具備半定量的功能；不足之處為敏感性低、樣本質(zhì)量要求高、勞動量大、花費較大，而且每種類型HPV都需要相應的探針。2)PCR-反向點雜交法：采用PCR體外擴增和DNA 反向點雜交相結(jié)合。利用HPV的基因特點設(shè)計特異引物，可以擴增出包含HPV基因型的目的片段，再將擴增產(chǎn)物與固定在膜條上的分型探針進行雜交，依據(jù)雜交信號的有無來判斷是否有這些HPV基因型的存在，可用于臨床HPV感染的輔助診斷。本法最大的缺點是雜交過程中容易出現(xiàn)污染，從而影響結(jié)果判斷。3)流式熒光雜交法：該技術(shù)將PCR擴增產(chǎn)物和微球上交聯(lián)的熒光標記物探針雜交，最后在多功能流式點陣儀上檢測熒光信號。目前商品化試劑盒可以一次性檢測分型27種型別的 HPV，缺點是擴增產(chǎn)物需開蓋易污染，并且檢測耗時6小時。4)熔解曲線法：在PCR 體系中加入標記有熒光基團與淬滅基團的探針，在PCR過程中擴增出與探針序列互補的單鏈寡核苷酸序列，在擴增完后增加熔解曲線分析過程，獲得熔解曲線，并得出各型別熔點(Tm值)，但缺點為各個目標物之間的熔解峰的熔點范圍間隔較近，容易鄰近熔解峰互相干擾，出現(xiàn)融合峰等情況。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種用于23種人乳頭瘤病毒基因分型檢測方法，以解決現(xiàn)有檢測技術(shù)中存在的PCR檢測時間偏長、分型數(shù)量不足、分型不清晰等缺點。