[發明專利]一種人源抗體表達質粒及其構建方法

有效

• 申請號: 202210346411.0
• 申請日: 2022-04-02
• 公開（公告）號: CN114480501B
• 公開（公告）日: 2023-01-24
• 發明（設計）人: 陳薇;李建民;郝勐;于長明;徐俊杰;侯利華;遲象陽;卞婷;陳旖;付玲;董韻竹;房婷;劉樹玲
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;C12N15/65;C12N15/13
• 代理公司: 北京市眾天律師事務所 11478
• 代理人: 李新軍

1.一種人源抗體表達質粒系統，其特征在于，所述人源抗體表達質粒系統包括人源抗體重鏈表達質粒和人源抗體輕鏈表達質粒，在所述人源抗體重鏈表達質粒含有序列如SEQID NO.12所示的重鏈可變區同源臂重組序列，所述人源抗體重鏈編碼基因通過自身攜帶的，并與重鏈可變區同源臂重組序列相同的同源臂重組序列通過同源重組整合到所述人源抗體重鏈表達質粒中，以及，在所述人源抗體輕鏈表達質粒含有序列如SEQ ID NO.14或SEQID NO.16所示的輕鏈可變區同源臂重組序列，所述人源抗體輕鏈編碼基因通過自身攜帶的，并與輕鏈可變區同源臂重組序列相同的同源臂重組序列通過同源重組整合到所述人源抗體輕鏈表達質粒中，所述人源抗體重鏈表達質粒還含有抗體重鏈信號肽編碼基因和抗體重鏈恒定區編碼基因，所述抗體重鏈信號肽編碼基因和抗體重鏈恒定區編碼基因之間的序列如SEQ ID NO.1所示，所述抗體重鏈信號肽編碼基因的序列如SEQ ID NO.18，抗體重鏈恒定區編碼基因的序列如SEQ ID NO. 19所示，以及，所述人源抗體輕鏈表達質粒還含有抗體輕鏈信號肽編碼基因和抗體輕鏈恒定區編碼基因，所述抗體輕鏈為Kappa鏈，在所述Kappa鏈信號肽編碼基因和Kappa鏈恒定區編碼基因之間的序列如SEQ ID NO.2所示，所述抗體Kappa鏈信號肽編碼基因的序列如SEQ ID NO. 20所示，抗體Kappa鏈恒定區編碼基因的序列如SEQ ID NO. 21所示，或者，所述抗體輕鏈為Lambda鏈，在所述Lambda鏈信號肽編碼基因和Lambda鏈恒定區編碼基因之間的序列如SEQ ID NO.3所示，所述抗體Lambda鏈信號肽編碼基因的序列如SEQ ID NO. 22所示，抗體Lambda鏈恒定區編碼基因的序列如SEQ IDNO.23所示。

2.權利要求1所述的人源抗體表達質粒系統的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

（1）獲得具有序列如SEQ ID NO.18所示的抗體重鏈信號肽編碼基因和如SEQ ID NO.19所示的抗體重鏈恒定區編碼基因的基因片段，在編碼抗體重鏈信號肽的下游基因和編碼抗體重鏈恒定區的基因上游分別引入Hpa I和Srf I兩個酶切位點，以及非抗體基因相關基因；或者

獲得具有如SEQ ID NO. 20所示的抗體Kappa輕鏈信號肽編碼基因和序列如SEQ IDNO. 21所示的抗體Kappa輕鏈恒定區編碼基因的基因片段，在編碼Kappa鏈信號肽的下游基因和編碼恒定區的基因上游分別引入Kpn I和Pme I兩個酶切位點以及非抗體基因相關基因；或者

獲得具有序列如SEQ ID NO. 22所示的抗體Lambda輕鏈信號肽編碼基因和序列如SEQID NO.23所示的抗體Lambda輕鏈恒定區編碼基因的基因片段，在編碼Lambda鏈信號肽的下游基因和編碼恒定區的基因上游分別引入Kpn I和Pml I兩個酶切位點以及非抗體基因相關基因；

（2）獲得含有序列如SEQ ID NO.12所示的重鏈可變區同源臂重組序列，以及具有人巨細胞病毒早期啟動子元件CMV、增強表達原件WPRE、poly A 尾基因、氨芐抗性基因的真核細胞表達載體的雙酶切片段，以及，獲得含有序列如SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.16所示的輕鏈可變區同源臂重組序列以及具有人巨細胞病毒早期啟動子元件CMV、增強表達原件WPRE、poly A 尾基因、氨芐抗性基因的真核細胞表達載體的雙酶切片段；

（3）將步驟（1）獲得基因片段利用同源重組方法克隆至步驟（2）表達載體的雙酶切片段。

3.一種應用權利要求1所述的人源抗體表達質粒系統制備人源化抗體的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

（1）使線性化的人源抗體重鏈表達質粒和人源抗體輕鏈表達質粒分別與待制備抗體的重鏈可變區基因與輕鏈可變區基因進行同源重組，其中，在重鏈可變區基因與輕鏈可變區基因的5’端分別設置有與所述人源抗體表達質粒系統重鏈可變區同源臂重組序列和輕鏈可變區同源臂重組序列相同的同源臂重組序列，所述重鏈可變區同源臂重組序列如SEQ IDNO.12所示，所述輕鏈可變區同源臂重組序列如SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.16所示；

（2）表達步驟（1）獲得的攜帶有重鏈可變區基因與輕鏈可變區基因的人源抗體重鏈表達質粒系統和人源抗體輕鏈表達質粒系統，并回收表達產物。