[發明專利]一種基于RPA-CRISPR-Cas12a體系可視化檢測陰道毛滴蟲的試劑盒及方法

在審

• 申請號: 202210331156.2
• 申請日: 2022-03-30
• 公開（公告）號: CN114774565A
• 公開（公告）日: 2022-07-22
• 發明（設計）人: 宮鵬濤;李珊;曹松高;姜維娜;李建華;張西臣;于艷輝;曹利利;李新;王曉岑
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12Q1/6893
• 分類號: C12Q1/6893;C12Q1/6804;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/90
• 代理公司: 北京和聯順知識產權代理有限公司 11621
• 代理人: 孫偉新

本發明公開了一種基于RPA?CRISPR?Cas12a體系可視化檢測陰道毛滴蟲的試劑盒及方法，所述試劑盒包含一對用于擴增陰道毛滴蟲actin基因的特異性RPA引物對、用于CRISPRCas12a反應的crRNA、熒光報告基團、側向流免疫層析報告基團和Cas12/13通用側流層析試紙條，以及用于CRISPR反應的緩沖液和Cas12a蛋白，用于擴增陰道毛滴蟲actin基因的特異性RPA引物對的核苷酸序列如SEQIDNO:11和16所示，用于CRISPRCas12a反應的crRNA互補的DNA的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示；該方法快速、可視，且特異性好，敏感度高，可作為一種臨床檢測陰道毛滴蟲的工具，對設備要求較低，特別適用于大規模人群篩查，為公共衛生機構的監測提供良好的技術手段。

技術領域

本發明涉及醫學檢測領域，具體為一種基于RPA-CRISPR-Cas12a體系可視化檢測陰道毛滴蟲的試劑盒及方法。

背景技術

陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis，TV)是一種胞外寄生蟲，屬于單細胞鞭毛原生動物寄生蟲，是一種微需氧寄生蟲。通過對上皮細胞的粘附作用，從而寄生于宿主的陰道和尿道，TV的發病機制主要為：寄生蟲對宿主細胞的殺滅、破壞陰道微生物穩態、通過激活宿主免疫反應引起炎癥以及免疫逃避反應等。陰道毛滴蟲侵入生殖系統或者泌尿系統后，不論對男性或是女性都會誘發感染，而造成較為嚴重的后果。該病可表現出生殖器癥狀，包括陰道紅斑、瘙癢和氣味，產生灰綠或黃綠色分泌物，排尿困難等。在女性感染中陰道毛滴蟲除引起陰道炎外、宮頸炎、尿道炎、不育等，還與許多圍產期并發癥相關，引起胎膜早破、早產、低體重兒等；在男性感染中可引起陰道毛滴蟲性疾病(包括非淋菌性尿道炎、前列腺炎等)，同時陰道毛滴蟲感染增加人類免疫缺陷病毒(HIV) 的傳播，并與宮頸癌和前列腺癌的發病率和嚴重程度有關。陰道毛滴蟲是全世界最常見的非病毒性傳播感染(STI)的病原體，每年將會引起大約2.7億人感染，然而，沒有表現出癥狀的感染比例估計在40％到80％之間，因此有效的診斷手段對陰道毛滴蟲的防治尤為重要。

目前常用的陰道毛滴蟲診斷方法有培養法、濕片鏡檢法等，近年來也陸續開發出酶聯免疫法(ELISA)、聚合酶鏈反應(PCR)、膠體金快速檢測、直接熒光抗體試驗(DFA)、膠乳凝集試驗(LAT)等用于檢測陰道毛滴蟲的方法。臨床上最常用的診斷方法是濕片鏡檢法，適用于有感染、分泌物、瘙癢或陰道異味癥狀的婦女，其操作簡單、省時，但由于檢測靈敏度跨度比較大，所以檢測率浮動較大，不適用于經驗不豐富的檢驗人員。培養法是目前臨床診斷上公認的金標準，但其檢測方法周期較長，費時費力，此外，培養法和濕片鏡檢法都需要顯微鏡人工檢查，不能實現自動化批量檢測，重復率較差。聚合酶鏈式反應(polymerasechain reaction，PCR)是一種靈敏度高、特異性強、反應迅速的診斷技術。基于PCR技術已經建立了多種方法用于診斷陰道毛滴蟲及基因型的鑒定，在PCR方法基礎上，通過引入熒光標記的探針，可以實時檢測靶標的擴增情況，稱為Real time PCR，這種方法不僅是快速、靈敏，同時也可以進行定量分析，這些方法無論在靈敏度還是在特異性上，都具有其它方法不可比擬的優勢，然而這種方法操作比較繁瑣，不僅需要相關專業操作培訓，還需采購體積較大、價格昂貴的設備，難以滿足非實驗室環境下現場檢測的要求。除了傳統PCR，環介導等溫擴增(LAMP)和重組酶聚合酶擴增技術(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)技術也已被開發用于檢測動物病原體。與傳統 PCR相比，LAMP檢測方法操作簡單，但反應中的多對引物的加入使其可靠性降低，可能產生假陽性檢測結果。RPA是一種新型的恒溫核酸擴增技術，其最顯著的優勢就是可在37～42℃的恒溫下實現特定核酸序列的擴增，可以在10～ 40min內完成數十億的DNA拷貝。RPA屬于等溫擴增技術，對儀器設備要求低，僅需要恒溫水浴鍋即可完成反應，無需精密儀器，但具有容易出現假陽性等缺點。