[發明專利]一種基于RPA-CRISPR-Cas12a體系可視化檢測陰道毛滴蟲的試劑盒及方法

在審

• 申請號: 202210331156.2
• 申請日: 2022-03-30
• 公開（公告）號: CN114774565A
• 公開（公告）日: 2022-07-22
• 發明（設計）人: 宮鵬濤;李珊;曹松高;姜維娜;李建華;張西臣;于艷輝;曹利利;李新;王曉岑
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12Q1/6893
• 分類號: C12Q1/6893;C12Q1/6804;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/90
• 代理公司: 北京和聯順知識產權代理有限公司 11621
• 代理人: 孫偉新

1.一種基于RPA-CRISPR-Cas12a體系可視化檢測陰道毛滴蟲的試劑盒，包括試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包含一對用于擴增陰道毛滴蟲actin基因的特異性RPA引物對、用于CRISPR Cas12a反應的crRNA、熒光報告基團、側向流免疫層析報告基團和Cas12/13通用側流層析試紙條，以及用于CRISPR反應的緩沖液和Cas12a蛋白。

2.根據權利要求1所述的一種基于RPA-CRISPR-Cas12a體系可視化檢測陰道毛滴蟲的試劑盒，其特征在于：所述Cas12a蛋白為pGEX-4T-1-Cac12a重組蛋白。

3.根據權利要求1所述的一種基于RPA-CRISPR-Cas12a體系可視化檢測陰道毛滴蟲的試劑盒，其特征在于：所述用于擴增陰道毛滴蟲actin基因的特異性RPA引物對的核苷酸序列如SEQ ID NO:11和16所示，用于CRISPR Cas12a反應的crRNA互補的DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

4.根據權利要求1所述的一種基于RPA-CRISPR-Cas12a體系可視化檢測陰道毛滴蟲的試劑盒及方法，其特征在于：所述用于CRISPR Cas12a反應的crRNA的報告探針為含有TTATT的單鏈DNA報告序列；用于熒光檢測時，熒光報告探針為5′6-FAM-TTATT-BHQ1-3′，用于側向流免疫層析檢測時，試紙條報告探針為5′6-FAM-TTATT-Biotin-3′。

5.根據權利要求1所述的一種基于RPA-CRISPR-Cas12a體系可視化檢測陰道毛滴蟲的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒檢測陰道毛滴蟲時，RPA反應體系20μL：其中包括RPA上游擴增引物0.50μM，RPA下游擴增引物0.50μM，1×Rehydration Buffer，MgOAc 14mM，待檢測樣本基因組DNA2μL，其余用水補足至20μL；RPA擴增程序為：恒溫37℃或39℃，反應30min。

6.根據權利要求1所述的一種基于RPA-CRISPR-Cas12a體系可視化檢測陰道毛滴蟲的試劑盒，其特征在于：所述用于CRISPR反應的緩沖液包括：Tris-HCl pH＝8.020mM、KCl100mM、MgCl₂5mM、DTT 1mM、5％甘油、肝素50μg/mL。

7.根據權利要求1所述的一種基于RPA-CRISPR-Cas12a體系可視化檢測陰道毛滴蟲的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒檢測陰道毛滴蟲時，CRISPR Cas12a檢測體系50μL：包含100ng RPA擴增靶基因產物，crRNA250nM、RNase Inhibitor0.5μL、探針200nM、Tris-HCl pH＝8.020mM、KCl 100mM、MgCl₂5mM、DTT1mM、5％甘油、肝素50μg/mL、加ddH₂O補足至50μL；CRISPR程序為：使用EasyPGX定量PCR儀37℃反應40min，每隔2min采集一次FAM熒光，或在37℃水浴鍋反應1h后加入無酶水補足至80uL后滴加于CRISPR Cas12a/Cas13a專用試紙條上肉眼觀察結果。

8.根據權利要求1所述的一種基于RPA-CRISPR-Cas12a體系可視化檢測陰道毛滴蟲的方法，其特征在于：將RPA特異性擴增與crRNA特異性序列鑒定相結合，使增強的Cas12a檢測更具特異性；并在37℃條件下進行檢測，適合在缺乏PCR儀等儀器設備的實驗室或現場使用；同時可以根據現有條件選取熒光法(通過儀器或藍光激發肉眼觀察)或側流層析試紙條法(直接裸眼觀察)。