[發(fā)明專利]莢膜型和非莢膜型流感嗜血桿菌的RPA-LFS檢測引物探針組合及其應用

在審

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• 申請日: 2022-03-28
• 公開（公告）號: CN114574603A
• 公開（公告）日: 2022-06-03
• 發(fā)明（設計）人: 高緒柱;王彥;王方;黃關宏;王蕾
• 申請（專利權）人: 連云港市第二人民醫(yī)院(連云港市臨床腫瘤研究所）
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 無錫蘇元專利代理事務所(普通合伙) 32471
• 代理人: 吳忠義

本發(fā)明公開了莢膜型和非莢膜型流感嗜血桿菌的RPA?LFS檢測引物探針組合及其應用；本發(fā)明的引物探針組合具有很好的特異性，對其他的菌株均無交叉擴增，能檢測1CFU/ul的流感嗜血桿菌，并且檢測靈敏度不受其他病原菌的干擾。本研究與雙重PCR檢測的結(jié)果一致，分別從209份樣本中檢出203份流感嗜血桿菌和63份莢膜型流感嗜血桿菌，檢出率分別為97.1％和63.2％。RPA?LFS與雙重PCR具有相同的實際應用性。本研究成功建立了基于Omp6和BexA基因檢測莢膜型和非莢膜型流感嗜血桿菌的RPA?LFS檢測方法，為后續(xù)快速檢測流感嗜血桿菌提供了方案，確保了患者的及時診斷和抗生素治療。

技術領域

本發(fā)明涉及莢膜型和非莢膜型流感嗜血桿菌的RPA-LFS檢測引物探針組合及其應用。

背景技術

流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae，H.influenzae)是一類革蘭氏陰性菌，。流感嗜血桿菌可以分為莢膜型和非莢膜型，莢膜型流感嗜血桿菌按血清學實驗結(jié)果可分為6種，分別為a型、b型、c型、d型、e型和f型。研究發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)血清型分布差異很大，其中b型流感嗜血桿菌致病性最強可以造成嚴重的腦膜炎和膿毒癥等。在一些發(fā)達國家，已經(jīng)使用b型H.influenzae結(jié)合疫苗進行常規(guī)免疫，并顯著降低了與b型H.influenzae相關的疾病的發(fā)病率，但大部分國家的發(fā)病率仍然較高。目前，傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)法是檢測流感嗜血桿菌的金標準，但流感嗜血桿菌是苛養(yǎng)菌，培樣營養(yǎng)要求高，除需厭氧環(huán)境外還需要一些特殊的生長因子，且培養(yǎng)時間較長，操作工序繁雜，因此流感嗜血桿菌培養(yǎng)分離率一直較低。這無疑延誤患者的診斷與治療時間并加速病情的惡化，快速、準確檢測流感嗜血桿菌并能鑒別出流感嗜血桿菌分型的方法迫在眉睫。

隨著分子診斷技術的快速發(fā)展，PCR技術已經(jīng)被廣泛應用于各種微生物檢測。TIANGuo Zhong建立了基于16S RNA基因檢測流感嗜血桿菌的PCR方法。該方法檢出流感嗜血桿菌敏感性為97.53％，但該方法不能鑒別出莢膜型和非莢膜型的流感嗜血桿菌。R.J.VANKETEL等基于Omp6和bexA基因建立了PCR檢測莢膜型和非莢膜型流感嗜血桿菌的方法，該方法根據(jù)莢膜相關蛋白bexA基因只存在于莢膜型流感嗜血桿菌，Omp6基因存在于所有流感嗜血桿菌中，成功建立了能夠區(qū)分不同分型流感嗜血桿菌的PCR方法。但該方法依賴于昂貴的儀器設備和專業(yè)的操作技術人員。Qilong Cao等人建立了基于Omp6基因檢測流感嗜血桿菌的MCDA-LFB(the multiple cross displacement amplification and nanoparticle-based lateral flow biosensor)方法，該方法能在58–65℃反應1h，結(jié)合膠體金試紙條的方法快速檢測流感嗜血桿菌。該方法雖然不依賴于昂貴的儀器設備，但存在引物設計復雜、反應時間較長以及假陽性等風險。

重組酶聚合酶擴增(Recombinase Polymerase Amplication，RPA)技術是最近興起的恒溫擴增技術，與其他技術相比該技術具有更好的特異性、靈敏度和操作便攜性。RPA利用重組酶打開雙鏈并使引物與目的片段結(jié)合，利用具有鏈置換活性的聚合酶Bsu識別引物3’端進行穩(wěn)定擴增，只需在30-45℃反應20min即可獲得大量的擴增產(chǎn)物。因此，該技術不依賴于精密的儀器設備和專業(yè)的操作人員。RPA擴增產(chǎn)物可以使用凝膠電泳、熒光檢測法和膠體金試紙條法。與凝膠電泳、熒光檢測法等不同的是，膠體金試紙條該技術是利用抗原-抗體結(jié)合原理實現(xiàn)擴增產(chǎn)物的檢測。通過在RPA反應體系中加入一條5’端標記FITC的探針，并使反向引物的5‘端標記Biotin，以獲得兩端均帶有標記的擴增產(chǎn)物。并將擴增產(chǎn)物使用特異性標記的試紙條檢測，根據(jù)檢測線是否顯色實現(xiàn)檢測擴增產(chǎn)物的目的。RPA技術與膠體金試紙條結(jié)合進一步增加了該技術的定點檢測特性。目前，RPA-LFS已經(jīng)被應用于各種病原菌檢測當中，如：金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、單增李斯特菌等。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明利用RPA-LFS技術建立了基于Omp6基因和bexA基因的快速鑒別莢膜型和非莢膜型流感嗜血桿菌的方法，該方法滿足了快速、靈敏、便攜的定點檢測需求。