[發(fā)明專利]一種圓錐鐵線蓮來(lái)源的香豆素合酶、基因、載體及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210312834.0
• 申請(qǐng)日: 2022-03-28
• 公開（公告）號(hào): CN114606212B
• 公開（公告）日: 2023-06-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱瑋;陶明磊;韓昊特;田景奎;李瑤函;李守信;劉勝志
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與腫瘤研究所（籌）
• 主分類號(hào): C12N9/10
• 分類號(hào): C12N9/10;C12N15/54;C12N15/70;C12N1/21;C12P17/06;C12R1/19
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 傅朝棟;張法高

本發(fā)明公開了一種圓錐鐵線蓮來(lái)源的香豆素合酶、基因、載體及其應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明所述的圓錐鐵線蓮香豆素合酶CtCOSY，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。本發(fā)明篩選獲得了圓錐鐵線蓮來(lái)源的CtCOSY基因，堿基序列如SEQ?ID?NO.2所示，并構(gòu)建了表達(dá)該酶的重組大腸桿菌，該重組大腸桿菌具有和4?香豆酸輔酶A一起催化2,4?二羥基肉桂酸合成傘形花內(nèi)酯的能力，對(duì)于推動(dòng)高產(chǎn)香豆素在工業(yè)中的應(yīng)用具有重要意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及圓錐鐵線蓮香豆素合酶及基因，還涉及含有該基因的重組表達(dá)載體和應(yīng)用。

背景技術(shù)

圓錐鐵線蓮(Clematis?terniflora?DC.)是一種分布于中國(guó)、日本、韓國(guó)等一些亞洲國(guó)家的傳統(tǒng)中藥材，香豆素是其主要藥用成分之一，用于抗炎、抗高血壓等疾病，具有較高的藥用價(jià)值。香豆素的合成過(guò)程中需要一個(gè)重要的環(huán)合酶：香豆素合酶(coumarinsynthase,COSY)，香豆素合酶屬于BAHD酰基轉(zhuǎn)移酶家族，參與了苯丙烷合成途徑，能夠催化2-羥基-p-香豆酰-CoA的順?lè)串悩?gòu)和內(nèi)酯化，產(chǎn)生簡(jiǎn)單香豆素傘形花內(nèi)酯。傘形花內(nèi)酯本身具有抗炎的藥效，并且對(duì)阻止肝臟纖維化有一定的功能，同時(shí)傘形花內(nèi)酯作為香豆素類化合物的基本結(jié)構(gòu)，是形成復(fù)雜香豆素化合物的核心結(jié)構(gòu)。

而根據(jù)以往報(bào)道，研究人員只表征過(guò)模式植物擬南芥中的香豆素合酶，而研究其他藥用植物中新型且高效催化香豆素自發(fā)的異構(gòu)化和內(nèi)酯化的合成通路上的關(guān)鍵酶--香豆素合酶具有重要理論及應(yīng)用意義。

圓錐鐵線蓮作為傳統(tǒng)藥材，藥用價(jià)值極高，而香豆素合酶參與香豆素合成途徑，是提高香豆素產(chǎn)量的重要酶之一。因此，深入對(duì)香豆素合酶的研究可以加深對(duì)藥用成分香豆素合成通路的了解，提高香豆素的產(chǎn)率，解決藥用植物中有效成分較低的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供了一種圓錐鐵線蓮來(lái)源的潛在的香豆素合酶(coumarinsynthase,CtCOSY)，為(a)或(b)：

(a)由SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

(b)在(a)限定的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有香豆素合酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供了一種圓錐鐵線蓮來(lái)源的香豆素合酶，其具體為(a)或(b)，其中：

(a)由SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

(b)在(a)限定的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有香豆素合酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。

第二方面，本發(fā)明提供了一種編碼上述第一方面所述香豆素合酶的基因，該基因的堿基序列如SEQ?ID?NO.2所示。

第三方面，本發(fā)明提供了一種重組表達(dá)載體，其通過(guò)在表達(dá)載體中插入第二方面所述的基因得到。

作為上述第三方面的優(yōu)選，所述表達(dá)載體為pET28a(+)質(zhì)粒。

第四方面，本發(fā)明提供了一種含有上述第三方面任一方案所述重組表達(dá)載體的大腸桿菌。

作為上述第四方面的優(yōu)選，大腸桿菌采用BL21(DE3)作為宿主菌。

第五方面，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)香豆素合酶的方法，該方法具體為：將第四方面中所述的大腸桿菌接種于培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，使編碼所述香豆素合酶的基因表達(dá)，收集表達(dá)蛋白并純化后得到所述圓錐鐵線蓮來(lái)源的香豆素合酶。

作為上述第五方面的優(yōu)選，接種所述大腸桿菌后的培養(yǎng)基中加入IPTG，于18-20℃誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)夜。

作為上述第五方面的優(yōu)選，收集的表達(dá)蛋白通過(guò)鎳柱純化，得到純化后的蛋白。