[發(fā)明專利]微血管體外培養(yǎng)方法及培養(yǎng)液

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210305895.4
• 申請日: 2022-03-25
• 公開（公告）號: CN114540278A
• 公開（公告）日: 2022-05-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王棟;李菁;祝海
• 申請（專利權(quán)）人: 青島大學(xué)
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 青島發(fā)思特專利商標(biāo)代理有限公司 37212
• 代理人: 王潤雨

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及微血管體外培養(yǎng)方法及培養(yǎng)液。本發(fā)明的微血管體外培養(yǎng)方法，具體包括分離、過濾和培養(yǎng)步驟，采用短時循環(huán)消化的方法從組織中分離微血管，減少了原代微血管細(xì)胞在酶溶液中的處理時間，降低了酶溶液對細(xì)胞的傷害，提高細(xì)胞活力。本發(fā)明還提供了一種微血管體外培養(yǎng)液，使得微血管可以在體外普通培養(yǎng)皿的硬基底表面以管狀形式生長，同時保留同一組織來源的周細(xì)胞圍繞在內(nèi)皮細(xì)胞周圍一起生長，更好地模擬體內(nèi)微血管，并且可以在體外長時間培養(yǎng)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究、藥理研究、藥物篩選和評價以及再生醫(yī)學(xué)研究及臨床應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及微血管體外培養(yǎng)方法及培養(yǎng)液。

背景技術(shù)

微血管又稱毛細(xì)血管，是分布于各種組織和器官中連通小動脈和小靜脈之間的細(xì)小血管，其分支眾多連通成網(wǎng)絡(luò)，也被稱為終末血管床。微血管在發(fā)育和組織再生過程中發(fā)揮著重要作用，很多疾病的發(fā)生伴隨著微血管結(jié)構(gòu)和功能的失調(diào)。微血管內(nèi)皮細(xì)胞周圍有周細(xì)胞包圍，其嵌入內(nèi)皮細(xì)胞基膜中，在促進(jìn)微血管發(fā)育、穩(wěn)定微血管結(jié)構(gòu)、調(diào)控微血管功能等方面發(fā)揮重要作用。

動物模型是研究微血管疾病的重要工具，但是，由于動物和人在基因、生理和病理等方面的差異，在動物模型研究中得出的科學(xué)結(jié)論或藥物實驗結(jié)果，在人體中不一定可行。因此，人的微血管模型具有重要的研究意義和市場價值。

現(xiàn)有的微血管培養(yǎng)模型主要使用商用培養(yǎng)液，如EGM2MV，所使用的細(xì)胞包括多個組織來源的不同細(xì)胞類型，例如，來自人臍帶靜脈血管的內(nèi)皮細(xì)胞、血液來源的血管內(nèi)皮細(xì)胞、動脈血管內(nèi)壁的血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎臟來源的內(nèi)皮細(xì)胞、大腦來源的周細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞定向分化產(chǎn)生的血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞等等，這些方法各有其缺點，比如：

1、血管細(xì)胞具有異質(zhì)性，不同器官的血管細(xì)胞具有各自特定的生物學(xué)特征，來自臍帶靜脈、動脈血管等大血管的內(nèi)皮細(xì)胞難以代替微血管的內(nèi)皮細(xì)胞，由誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化生成的血管細(xì)胞難以反映某一特定組織或器官的微血管生物學(xué)特征。

2、微血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞的共培養(yǎng)模型是研究二者相互作用，以及微血管穩(wěn)定性的重要工具。在現(xiàn)有的微血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞共培養(yǎng)模型中，內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞分別來自不同的器官，例如將來自臍帶靜脈血管的內(nèi)皮細(xì)胞和來自大腦的周細(xì)胞共培養(yǎng)，由于血管細(xì)胞的異質(zhì)性，不同器官來源的內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞的共培養(yǎng)模型難以準(zhǔn)確反映微血管的組織特異性。

3、現(xiàn)有的常用方法中，血管內(nèi)皮細(xì)胞在普通培養(yǎng)皿的二維表面上以單層細(xì)胞片的形式生長，丟失了體內(nèi)原有的管狀形態(tài)。

4、現(xiàn)有的常用方法中，血管內(nèi)皮細(xì)胞只有在水凝膠(如Matrigel、fibrin或膠原)表面或內(nèi)部才能形成管狀結(jié)構(gòu)，但是很難在體外長期培養(yǎng)。在水凝膠表面形成的微血管僅能維持幾天時間，水凝膠內(nèi)部所形成的管狀微血管結(jié)構(gòu)一般最多培養(yǎng)兩周時間。體外培養(yǎng)時間是限制體外微血管模型的一個重要因素。

5、利用水凝膠形成微血管的方法成本較高，三維微血管模型難以利用常規(guī)的免疫染色方法進(jìn)行表征和檢測，難以進(jìn)行高通量篩選實驗。

發(fā)明內(nèi)容

根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)上存在的缺陷，結(jié)合目前的研究前沿，本發(fā)明提供了微血管體外培養(yǎng)方法及培養(yǎng)液。

本發(fā)明是采用以下的技術(shù)方案實現(xiàn)的：

本發(fā)明提供了一種微血管體外培養(yǎng)方法，具體包括以下步驟：

步驟(1)、分離：將組織塊剪碎，置于膠原酶溶液中消化，分離膠原酶溶液中的細(xì)胞懸液離心，將獲得的細(xì)胞沉淀重懸于PBS溶液中；將剩余組織塊再次加入膠原酶溶液繼續(xù)消化，收集細(xì)胞懸液并離心，離心后重懸；重復(fù)以上步驟，直至組織塊消化完為止，離心收集所有細(xì)胞沉淀，重懸于PBS溶液中；

步驟(2)、過濾：將步驟(1)分離得到的細(xì)胞懸液，用細(xì)胞篩網(wǎng)進(jìn)行過濾，紅細(xì)胞和單細(xì)胞以及死細(xì)胞會通過篩網(wǎng)，而微血管段留在篩網(wǎng)上，用PBS溶液反向沖洗，收集微血管段；