[發明專利]凝血酶-抗凝血酶Ⅲ復合物測定試劑盒及其制備方法與應用

在審

• 申請號: 202210295923.9
• 申請日: 2022-03-23
• 公開（公告）號: CN114705870A
• 公開（公告）日: 2022-07-05
• 發明（設計）人: 楊建;吳晗琪;黃金梅;王保升
• 申請（專利權）人: 廣州萬孚生物技術股份有限公司
• 主分類號: G01N33/86
• 分類號: G01N33/86;G01N33/573;G01N33/577;G01N33/535;G01N33/543;G01N21/76
• 代理公司: 廣州廣典知識產權代理事務所(普通合伙) 44365
• 代理人: 萬志香;顧書玲

1.一種凝血酶-抗凝血酶Ⅲ復合物，其特征是，其由凝血酶與交聯劑Sulfo-EGS交聯后，再與抗凝血酶Ⅲ交聯而成，所述凝血酶與交聯劑Sulfo-EGS的質量用量比為5～50:1，所述凝血酶與抗凝血酶Ⅲ的質量用量比1:0.8～1.5。

2.根據權利要求1所述的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ復合物，其特征是，所述凝血酶與交聯劑Sulfo-EGS的質量用量比為9～10:1。

3.根據權利要求1或2所述的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ復合物，其特征是，所述凝血酶與抗凝血酶Ⅲ的質量用量比1：1～1.1。

4.一種權利要求1所述的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ復合物的制備方法，其特征是，包括以下步驟：

A.取所述凝血酶用PBS緩沖液進行置換原液，加入Sulfo-EGS，室溫下孵育0.8h～1.5h，進行活化，得混合液；

B.取所述抗凝血酶Ⅲ用PBS緩沖液進行置換原液后，立即全部加入上述混合液中，室溫下孵育1h～1.5h，進行交聯；

C.交聯完成后，脫鹽純化，混勻，得到凝血酶-抗凝血酶Ⅲ復合物的溶液。

5.根據權利要求4所述的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ復合物的制備方法，其特征是，步驟A中，所述孵育1h～1.5h，優選為1h；

和/或步驟B中，所述孵育1h～1.2h，優選為1h。

6.一種凝血酶-抗凝血酶Ⅲ復合物測定試劑盒，其特征是，包括權利要求1-3任一項所述的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ復合物作為校準品。

7.根據權利要求6所述的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ復合物測定試劑盒，其特征是，還包括以下至少一種：

包被有凝血酶單克隆抗體的磁性微球結合物的溶液、

標記有抗凝血酶Ⅲ單克隆抗體的酶標結合物的溶液、

底物液。

8.根據權利要求7所述的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ復合物測定試劑盒，其特征是，所述包被有凝血酶單克隆抗體的磁性微球結合物中的磁性微球為磁微粒；優選地，所述磁微粒的直徑為1000～3000納米。

9.根據權利要求7所述的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ復合物測定試劑盒，其特征是，在所述包被有凝血酶單克隆抗體的磁性微球結合物的溶液中，所述包被有凝血酶單克隆抗體的磁性微球結合物的濃度為0.1～0.3mg/mL。

10.根據權利要求7所述的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ復合物測定試劑盒，其特征是，所述標記有抗凝血酶Ⅲ單克隆抗體的酶標結合物為堿性磷酸酶與抗凝血酶Ⅲ單克隆抗體的結合物。

11.根據權利要求10所述的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ復合物測定試劑盒，其特征是，所述標記有抗凝血酶Ⅲ單克隆抗體的酶標結合物的濃度為0.4～0.6μg/mL。

12.根據權利要求6所述的凝血酶-抗凝血酶Ⅲ復合物測定試劑盒，其特征是，所述校準品為用Tris-HCl校準品稀釋液將凝血酶-抗凝血酶Ⅲ復合物稀釋，濃度為4～20ng/mL。

13.一種凝血酶-抗凝血酶Ⅲ復合物檢測方法，其特征是，包括以下步驟：

獲得待檢測樣品；

以權利要求1-3任一項所述凝血酶-抗凝血酶Ⅲ復合物作為校準品制作標準曲線；將待測樣品和包被有凝血酶單克隆抗體的磁性微球結合物加入到反應管中進行第一次孵育處理，清洗；

加入標記有抗凝血酶Ⅲ單克隆抗體的酶標結合物的溶液，進行第二次孵育處理，形成雙抗體夾心免疫復合物，清洗；

加入底物液，測定發光信號；

待測樣本的發光信號值經標準曲線計算后得出凝血酶-抗凝血酶Ⅲ復合物濃度。