[發明專利]高產PHA的基因重組菌及其構建方法

有效

• 申請號: 202210280731.0
• 申請日: 2022-03-22
• 公開（公告）號: CN114381415B
• 公開（公告）日: 2022-11-15
• 發明（設計）人: 尹進;王禺;張樺宇;李英滋
• 申請（專利權）人: 深圳藍晶生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12N15/31;C12P7/64;C12P7/62
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 商秀玲

本發明涉及高產PHA的基因重組菌及其構建方法，提供了可用于生產聚羥基脂肪酸酯（PHA）的工程化微生物，更具體地是高產PHA的重組富養羅爾斯通氏菌，其中所述重組富養羅爾斯通氏菌包含上調phaJ基因的啟動子，并進一步包括突變的phaC基因。本發明提供的重組富養羅爾斯通氏菌可用于生產PHA中的3?羥基丁酸與3?羥基己酸共聚酯(PHBHHx)。

技術領域

本發明屬于基因工程和發酵工程領域，更具體地，本發明涉及一種高產聚羥基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates，PHA）的基因重組菌及其制備方法和用途。

背景技術

聚羥基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates，PHA）是一類由微生物合成的可再生可降解且具有多元材料學性能的高分子聚合物，在醫學、材料和環保領域有著廣泛的應用前景。聚羥基脂肪酸酯廣泛存在于微生物細胞內，主要作為碳源及能量的貯存載體。PHA根據單體種類、聚合方式的不同，具有從堅硬質脆的硬塑料到柔軟的彈性體等一系列多樣性的材料學特性。

聚羥基丁酸酯（PHB）是一種商業上有用的復合生物聚合物，是由大量細菌產生的細胞內材料。聚羥基丁酸酯是基于聚合物的化學和物理性質的有用的生物材料，具有多種潛在應用，包括用作可生物降解/熱塑性材料，某些抗生素有機合成的手性中心來源以及用作藥物遞送和骨替代的基質。3-羥基丁酸與3-羥基己酸共聚酯（PHBHHx）是PHA中的一種，以不溶性微球狀顆粒狀形式存在于細胞質中。

富養羅爾斯通氏菌（Ralstonia eutropha，也稱為Cupriavidus necator）是研究聚羥基脂肪酸酯（PHA）合成的重要模式細菌，是目前研究較多的用于PHB菌株生成的菌株。當碳過剩、氮缺乏時，菌株可以大量積累PHB；而當胞內其他碳源代謝旺盛時，PHB的合成會受到影響。

PHB在富養羅爾斯通氏菌體內的合成途徑已被闡述清楚。酯酰輔酶A（Acyl-CoA）在phaA（β-酮基硫解酶）的作用下合成乙酰乙酰輔酶A（acetoacetyl CoA），再通過phaB（乙酰乙酰輔酶A還原酶）合成3-羥基丁酸。同時phaJ（(R)-烯酰輔酶A水合酶）脫氫產生3-羥基己酸，在phaC（PHA聚合酶）的作用下聚合兩種化合物形成PHBHHx。

為了更高效的生產PHBHHx，并使其中的3-羥基己酸單體的摩爾比控制在特定比例，亟需開發一種用于合成PHA的新型微生物。

發明內容

本發明通過提供一種高產PHA的重組富養羅爾斯通氏菌而滿足了本領域的上述需要。本發明使用富養羅爾斯通氏菌H16（Ralstonia eutropha H16，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號CGMCC 1.7092）作為出發菌株，對菌株進一步改造，使其發酵性能進一步提高。

在一個方面，本發明提供了一種重組富養羅爾斯通氏菌，其中所述重組富養羅爾斯通氏菌基因組中引入了上調phaJ基因的啟動子，并且所述重組富養羅爾斯通氏菌中包括引入的phaC突變基因。在本發明所提供的重組富養羅爾斯通氏菌中，所述引入的phaC突變基因的表達使得所述重組富養羅爾斯通氏菌合成3-羥基丁酸與3-羥基己酸共聚酯。在本發明的一個實施方案中，所述重組富養羅爾斯通氏菌生產3-羥基己酸在3-羥基丁酸與3-羥基己酸共聚酯中的比例增加。

在本發明該方面的一些實施方案中，通過同源重組的方式，在所述重組富養羅爾斯通氏菌基因組中引入了上調phaJ基因的啟動子。在本發明的優選實施方案中，通過同源重組的方式，利用帶有啟動子序列的質粒，在phaJ基因上游插入上調phaJ基因的啟動子序列。在本發明所提供的重組富養羅爾斯通氏菌中，優選地所述phaJ基因是phaJ4b基因。還優選地，所述啟動子序列選自phaJ43啟動子序列SEQ ID NO.3、phaJ210啟動子序列SEQ IDNO.8、phaJ183啟動子序列SEQ ID NO.9和phaJ225啟動子序列SEQ ID NO.10；更優選地，所述啟動子序列是phaJ43啟動子序列SEQ ID NO.3。